金粳818抗咪唑啉酮類除草劑基因的功能標記開發(fā)與應用

王廣達 高鵬, 楊文艷 崔傲 趙劍華 馮志明, 曹文磊, 陳宗祥, 左示敏, ,*

(1揚州大學 農(nóng)學院 江蘇省作物遺傳生理重點實驗室/植物功能基因組學教育部重點實驗室/江蘇省作物基因組學和分子育種重點實驗室，江蘇 揚州225009；2揚州大學 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009; *通信聯(lián)系人, E-mail: smzuo@yzu.edu.cn)

隨著勞動力成本及土地規(guī)模化程度的上升，直播稻在我國水稻生產(chǎn)上呈明顯擴大態(tài)勢。相對于移栽稻，直播稻田更容易滋生雜草和雜草稻。清除雜草有多種方法，施用除草劑無疑是最經(jīng)濟有效的策略，尤其是利用殺草譜廣、低毒高效的除草劑。然而，很多廣譜性除草劑在消滅雜草的同時也給水稻造成傷害，影響其生長發(fā)育和產(chǎn)量。因此，培育抗廣譜性除草劑的水稻顯得尤為重要。

乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）抑制劑是現(xiàn)在被廣泛應用的一類除草劑，其除草譜廣、低毒高效、選擇性強、對人和動物十分安全[1]，具體包括咪唑啉酮類(imidazolinones，IMs)、磺酸脲類(sulfonylureas，SUs)、三唑并嘧啶類(triazolopyrimidines，TPs)、嘧啶硫代苯甲酸酯類(pyrimidinyhhiobenzoate，PTBs)和磺酰胺羰基三唑啉酮類(sulfonylaminocarbonyltriazolinone，SCTs)等多種類型[2]。該類除草劑被根系等器官吸收后，通過植物體內(nèi)的維管系統(tǒng)傳導到植物全株，在分生組織中積累，抑制植物中的ALS活性，破壞植物體內(nèi)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的合成，最終導致植物死亡[3]。通過大規(guī)模誘變篩選，國外學者率先獲得了抗ALS抑制劑水稻創(chuàng)新種質(zhì)，并培育推廣了相應的抗除草劑水稻品種[4]。然而，隨著同類型除草劑大量地施用，不少種植田塊均發(fā)現(xiàn)了抗性雜草[5-6]。研究顯示，對ALS抑制劑的抗性可分為靶標抗性和非靶標抗性；靶標抗性主要為ALS蛋白的氨基酸突變造成，非靶標抗性則與ALS抑制劑敏感性減弱有關，但其具體分子機制還很不清楚[7-9]。通過對抗性雜草中的靶標ALS基因序列分析，研究人員先后發(fā)現(xiàn)至少有 20個氨基酸位點的突變可導致植物對 ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性[10-14]。

近年來，我國學者也先后通過誘變篩選策略，獲得了 ALS抑制劑類除草劑抗性水稻種質(zhì)(品種)[15]。為了加速這些種質(zhì)在抗ALS抑制劑類除草劑水稻新品種選育中的應用，先后有學者開發(fā)了針對這些ALS突變型的功能標記。陳濤等[16]基于四引物擴增受阻突變體系PCR原理，開發(fā)了黃華占M-1背景下的ALS突變型基因（第548位氨基酸突變）的功能標記。王芳權等[17]采用等位基因特異 PCR原理開發(fā)了金粳818背景中的ALS突變型基因的功能標記 AS-ALS，該標記中的抗、感等位基因的特異引物間只在末端一個堿基上存在差異，因此，在實際操作中容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，而且對雜合基因型的鑒定需要擴增兩次方可獲悉。針對單堿基變異，目前有多種基于PCR的分子標記檢測方法，其中在分子標記輔助育種中應用最普遍的是CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)標記[18]。該標記的主要原理是利用單堿基引起某個限制性內(nèi)切酶識別基序的變化，PCR對產(chǎn)物進行酶切以區(qū)分不同等位變異[18]。然而，有些單堿基變異所在區(qū)域并不是某個限制性內(nèi)切酶的識別位點，無法直接開發(fā)CAPS標記。但是，在這些單堿基變異中，有些可以通過額外突變1～2個堿基并使其與該單堿基變異位點中的一種等位變異間組成某個限制性內(nèi)切酶的識別基序，而與另一種等位變異間不能組成相應的酶切基序。利用該原理，我們可以在PCR引物設計過程中引入個別堿基突變，實現(xiàn)特異單堿基變異的區(qū)分，即dCAPS（derived CAPS）標記[18]。近年來，由英國 LGC公司研發(fā)的競爭性等位基因特異性 PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）標記正在被遺傳育種學者所認可[19]，該標記可廣泛用于各種單堿基變異的特異性鑒別。其具體設計原理是利用等位基因間的單堿基變異，分別設計出針對不同等位基因特異擴增的PCR引物，實現(xiàn)相應等位基因的特異擴增。以上兩種標記均為共顯性標記，可同時區(qū)分特定位點上的三種基因型，且檢測精準性高，因而更具育種應用價值。

為了進一步豐富金粳818中ALS突變型基因的功能標記類型，本研究分別采用 dCAPS和 KASP標記原理開發(fā)了兩種新的功能標記dC-ALS-627和K-ALS-627，并發(fā)現(xiàn)其在抗除草劑水稻新品種選育中具有廣泛的應用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）金粳818是由津稻9618和津稻1007雜交育成的粳型常規(guī)水稻品種（天津市水稻研究所），前人研究顯示其對 ALS抑制劑類除草劑咪草煙具有較強的抗性[20]。

2）禾粳 1819、沭粳 1901、華粳 1803、南粳46、南粳52、武運粳23、鎮(zhèn)稻11、鎮(zhèn)稻14、鎮(zhèn)稻18、淮稻5號、揚粳103、揚育粳2號、揚育粳3號、華粳8號、淮119、武運粳27、武運粳32、武運粳80、揚農(nóng)稻1號、鹽粳11、鹽粳13、鹽粳15、鹽粳16、鹽粳6號、鎮(zhèn)稻99、大糧202、泗稻12、泗稻15、新科稻21、徐稻5號、原旱稻3號、金粳18、金粳787、連粳10、連粳4號、蘇墾118、蘇秀867、揚粳818、武粳66、寧5718共40份水稻品種（系）用于驗證本研究開發(fā)的功能標記在水稻育種中的應用潛力。

3）以金粳818為父本，常規(guī)粳稻品種南粳505為母本配置的雜交種及其衍生的BC2F2群體，以及以金粳818和華粳0029為親本配置的雜交種，主要用于研究標記檢測的效果及目標抗性基因的顯隱性特性。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取與ALS基因克隆

用CTAB法提取待測水稻葉片的基因組DNA。根據(jù) NCBI數(shù)據(jù)庫注冊的日本晴 ALS基因（LOC4329450）編碼區(qū)序列設計一對引物ALS-F和ALS-R(表1)，引物設計采用Primer Premier 5.0軟件進行。用KOD FX（TOYOBO）高保真酶對金粳818基因組DNA進行擴增，參照天根生化科技（北京）有限公司普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的使用方法對目的DNA片段進行回收，膠回收產(chǎn)物連入pEASY-Blunt克隆載體中，采用大腸桿菌轉(zhuǎn)化法進行轉(zhuǎn)化，然后挑取單克隆菌落擴大培養(yǎng)，取20 μL菌液送尚亞生物公司測序。

1.2.2 序列比對與標記開發(fā)

分別從NCBI和Gramene網(wǎng)站的GeneBank中下載粳稻品種日本晴和秈稻品種9311的ALS基因編碼區(qū)序列(CDS)，用BioEdit軟件對測序獲得的金粳818ALS基因編碼區(qū)序列進行比對分析。

在此，我們采用衍生酶切擴增多態(tài)性序列（derived cleaved amplified polymorphic sequences,dCAPS）分析技術開發(fā)dCAPS標記，利用dCAPS Finder 2.0網(wǎng)站，對野生型和突變體基因突變區(qū)段進行序列分析，結(jié)合Primer Premier 5.0軟件，在堿基變異處雙側(cè)設計相應的引物（表 1）。另外，基于KASP原理設計兩條 3＇末端不同的正向引物K-ALS627N-HEX和K-ALS627S-FAM，以及一條反向通用引物K-ALS627S-N（表1）。

1.2.3 dCAPS標記的PCR擴增、酶切和電泳檢測

以提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR體系為DNA模板1 μL，10×PCR緩沖液（含MgCl2）2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）0.4 μL，上游引物 dC-ALS-627-F（0.5 μmol/L）0.4 μL，下游引物dC-ALS-627-R（0.5 μmol/L）0.4 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，ddH2O 15.4 μL。反應總體積20 μL。擴增條件為 95℃下 5 min；95℃下 30 s，58℃下 30 s，72℃下 30 s，32 個循環(huán)；72℃下延伸 10 min，結(jié)束反應。擴增產(chǎn)物采用 NEB生物技術有限公司的DdeⅠ限制性核酸內(nèi)切酶進行酶切，酶切體系包括PCR 產(chǎn)物 8.8 μL，CutSmart緩沖液 1 μL，DdeⅠ酶（1 U/μL）0.2 μL，37℃下水浴 2 h。酶切產(chǎn)物經(jīng) 4%瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠成像儀拍照并記錄結(jié)果。

1.2.4 KASP標記PCR檢測方法

反應體系包括 DNA（10～20 ng/μL）5.0 μL，熒光引物混合液（8 μmol/L）0.14 μL，2×KASP 預混液5.0 μL（1×）。反應條件：94℃下激活15 min；94℃下變性20 s，61℃～55℃下退火60 s（每一個循環(huán)降低0.6℃），10個循環(huán)；94℃下變性20 s，55℃下退火60 s，26個循環(huán)；30℃下延伸1 min；用ddH2O設置 3個空白對照。利用Bio-Rad CFX熒光定量PCR 儀（CFX Connect）和 Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件對KASP基因進行分型擴增和結(jié)果分析。

1.2.5 抗性鑒定

抗性鑒定所用除草劑咪唑乙煙酸，為咪唑啉酮類除草劑（山東先達農(nóng)化股份有限公司，有效成分含量5%）。在長方體塑料盆（長59 cm、寬18 cm、高14 cm，土壤厚度12 cm）中點播金粳818、常規(guī)粳稻南粳505，以及南粳505/金粳818回交的BC2F2種子，其中金粳818和南粳505各播12粒，回交種播40粒。3葉1心時，將咪唑乙煙酸（水劑）溶液稀釋1000倍按300 L/hm2噴霧，30 d后調(diào)查抗性，葉片全部枯萎或死亡為感，植株存活為抗。于噴施藥劑前一天取樣（葉尖2～3 cm）用于基因型檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 金粳818中抗除草劑基因ALS的序列分析

前人研究顯示[20]，ALS基因的突變是導致金粳818對咪唑啉酮類除草劑產(chǎn)生抗性的原因。為了開發(fā)功能位點特異的分子標記，本研究再次對金粳818的ALS基因進行了測序。通過序列比對，我們發(fā)現(xiàn)金粳818與感除草劑品種日本晴、9311之間分別存在32和9個堿基變異（圖1）。其中在第1880 bp和1927 bp處日本晴和9311的堿基相同，且均與金粳818不同。這兩個變異分別引起金粳818中的ALS基因第627位和第643位氨基酸發(fā)生改變。結(jié)合前人在紅米稻抗除草劑上的研究結(jié)果[21]，可認為627位氨基酸改變是導致金粳818對咪唑啉酮類除草劑產(chǎn)生抗性的原因，這與費云燕等[20]的結(jié)果一致。本研究將金粳 818中的 ALS基因命名為ALS627N，野生型的ALS基因命名為ALS627S。

表1 本研究涉及的引物序列Table 1. Primer sequences involved in this study.

圖1 ALS基因序列比對結(jié)果Fig. 1. ALS gene sequence alignment results.

圖2 兩種標記的相關信息Fig. 2. Information of the two molecular markers.

2.2 金粳818中抗除草劑基因ALS627N的功能標記開發(fā)

針對ALS627N基因中的第1880處的單堿基變異，首先開發(fā)了dCAPS標記dC-ALS-627(圖2)。當目標堿基位點為A的時候，該標記的擴增不能被DdeⅠ酶進行切割，擴增產(chǎn)物為178 bp；相反，如果是堿基G，那么其PCR擴增產(chǎn)物可以被DdeⅠ酶切割為156 bp和25 bp。用引物dC-ALS-627對3份親本材料金粳818、南粳505、華粳0029以及兩份雜交種南粳 505/金粳 818、華粳 0029/金粳 818的基因組DNA進行擴增，并采用限制性核酸內(nèi)切酶DdeⅠ做酶切。結(jié)果顯示(圖 3-A)，金粳 818的擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切后的電泳條帶為 178 bp，而南粳 505和華粳0029的擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切后片段大小均為156 bp，說明金粳818中的ALS627N基因在1880位點攜帶的是A堿基，而另兩個品種攜帶的均不是該堿基；兩個雜交 F1材料的擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切后均產(chǎn)生了這兩種條帶，分別代表兩個親本，證明該標記可以區(qū)分雜合基因型。

圖3 三種分子標記檢測結(jié)果Fig. 3. Detection results of three molecular markers.

我們同時基于該功能性單堿基變異開發(fā)了KASP標記K-ALS-627（圖2），在金粳818等位基因ALS627N的特異引物前加上5-六氯熒光素氨基磷酸酯（HEX）的熒光信號標簽，在野生型等位基因ALS627S特異引物前加上羧基熒光素（FAM）的熒光信號標簽。通過熒光PCR擴增，結(jié)果顯示金粳818和兩份野生型材料分別呈現(xiàn)出藍光和黃光，而雜種F1則呈現(xiàn)出綠光，表明K-ALS-627標記同時可以區(qū)分ALS位點上的3種基因型（圖3-B）。

費云燕等[18]的研究顯示，SSR分子標記RM7413與金粳818中的抗除草劑基因ALS627N緊密連鎖。我們進一步用RM7413對相關樣品進行檢測（圖3-C），結(jié)果與用dC-ALS-627和K-ALS-627檢測的一致。

2.3 BC2F2代水稻植株的標記檢測及表型分析

我們構建了南粳505與金粳818間的BC2F2代回交群體，分別利用標記dC-ALS-627和K-ALS-627檢測群體中的部分個體基因型，發(fā)現(xiàn)兩種標記均可有效區(qū)分ALS位點中的3種基因型（圖4）。我們進一步采用咪唑乙煙酸對群體中的各個體進行噴施處理，發(fā)現(xiàn) ALS627N基因型和雜合基因型的所有植株(37株)均能正常生長，而基因型為ALS627S的野生型植株(11株)在處理后均表現(xiàn)生長受限，絕大多數(shù)在30 d后枯萎或死亡，圖5為部分單株的表型。結(jié)果進一步證實，ALS627N是抗咪唑啉酮類除草劑顯性基因，采用本研究開發(fā)的兩種功能標記均可在雜交早期世代篩選到純合基因型抗除草劑個體。

2.4 兩種功能標記在水稻新品種選育中的應用

為進一步驗證兩種標記在水稻抗咪唑啉酮類除草劑新品種育種中的應用價值，我們分別利用各標記分析了 40份不抗該除草劑的水稻品種在 ALS位點上的基因型。經(jīng)dCAPS標記dC-ALS-627分析后，能清楚地發(fā)現(xiàn)金粳818與其他40份材料的基因型帶型存在明顯差異(圖6-A)；同樣，K-ALS-627標記也可以明顯區(qū)分40份水稻品種與金粳818(圖6-B)。結(jié)果表明，本研究開發(fā)的兩種標記均可有效區(qū)分金粳818中的ALS627N基因與其他不同來源的水稻種質(zhì)中的ALS基因，表明其可廣泛用于現(xiàn)有水稻品種抗咪唑啉酮類除草劑改良或新品種選育。

the heterozygouus type of ALS genne (with a G/A mmutation site base)).圖4 dC-ALSS-627和K-ALLS-627標記對BC2F2水稻植株株的基因型檢檢測結(jié)果Fig. 4. Genottyping of BC22F2 generationn rice plants uusing dC-ALS--627 and K-ALLS-627 markerrs.

圖5 咪唑乙乙煙酸處理后的的BC2F2水稻植植株表型Fig. 5. Phenottypes of BC2F22 populations aafter treatmentt with imazethaapyr.

圖6 利用dC-AALS-627和K--ALS-627標記記篩選抗除草劑劑水稻資源Figg. 6. Screeningg herbicide reesistant rice reesources usingg dC-ALS-6277 and K-ALS-6627 markers.

3 討論

從 20世紀紀 80年代開開始，科學家家們就已經(jīng)致致力于抗除草劑劑作物的研研究，以抗磺磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑為主，經(jīng)過多年的研究，成功培育出許多抗性作物[22,23]。天津農(nóng)業(yè)科學院選育的粳稻品種金粳 818，因為其對咪唑啉酮類除草劑具有較強抗性，近年在生產(chǎn)上頗受老百姓喜愛。前人研究顯示[20]，金粳818中的除草劑抗性與其ALS基因發(fā)生突變有關。本研究對金粳818中的ALS基因進行了測序比較，進一步證實金粳818的除草劑抗性與其ALS基因第1880處的單堿基變異有關，這與之前的研究報道一致[20]。對金粳818與南粳505的回交群體中的雜合基因型個體進行除草劑處理，證實金粳818中ALS627N為顯性抗除草劑基因，這為通過除草劑處理篩選出攜帶 ALS627N基因型個體提供了依據(jù)。然而，相比于標記輔助選擇，表型篩選還是易受外界因素干擾，也不能區(qū)分雜合基因型與純合基因型。王芳權等[17]率先開發(fā)了金粳818背景中的ALS等位基因特異PCR標記AS-ALS，包括兩個引物組合F1N和F1M，其中感除草劑等位基因只能被F1N引物組合擴增，抗除草劑等位基因型只能被F1M引物組合擴增，而雜合基因型能同時被兩對引物F1N和F1M擴增，因此，可以通過兩輪PCR有效區(qū)分ALS位點的3種基因型。然而，由于擴增抗、感等位基因的特異引物間只在末端1個堿基上存在差異，因此，在實際操作中容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，而且不能對雜合基因型進行一次性檢測。

為了開發(fā)特異性和準確性更高的功能標記，我們采用dCAPS標記設計原理，在金粳818的功能變異位點處開發(fā)了一個dCAPS標記dC-ALS-627，盡管在檢測過程中需要增加一步酶切消化環(huán)節(jié)，但耗時并不長（1～2 h），結(jié)果卻十分準確，基本不存在假陽性，且可一次性區(qū)分雜合基因型與純合基因型，因此，dC-ALS-627具有較好的實際應用價值。當然，在檢測過程中，有時會出現(xiàn)酶切不徹底的情況，此時，攜帶感除草劑的野生型位點會呈現(xiàn)出類似雜合基因型的帶型，即出現(xiàn)雙帶；但是對于篩選抗性純合型（ALS627N）個體而言，結(jié)果則不受影響。另外，由 LGC公司研發(fā)的競爭性等位基因特異性PCR方法（Kompetitive Allele Specific PCR，KASP）是檢測單堿基變異的一個非常有效的標記方法。近年來，由于這一標記方法的檢測成本下降，尤其是可以通過普通熒光PCR儀進行檢測分型，不需要添置 LGC公司研制的高通量儀器設備，使得這一標記技術正在被很多中小型研究室廣泛接受。本研究針對金粳818的功能變異位點也開發(fā)一個KASP標記 K-ALS-627。利用 LGC公司的反應混合液，在Bio-Rad CFX熒光定量PCR儀（如CFX Connect）上擴增，不需要凝膠電泳即可獲得抗、感及雜合基因型分型結(jié)果，具有效率高且容易實現(xiàn)通量化的優(yōu)勢。采用以上兩種功能標記均可有效區(qū)分ALS位點中的3種基因型，因此，可在雜交分離的早期世代獲得純合基因型個體，提高選擇效率。為了評估兩個功能標記在粳稻品種育種中的應用前景，我們分析了 40個隨機選自江蘇粳稻不同生態(tài)區(qū)的粳稻品種在相應位點上的基因型，結(jié)果顯示，這些品種均不帶有金粳818中的ALS627N功能變異，結(jié)合這些品種在推廣過程中未聽說有抗咪唑啉酮類除草劑的宣傳信息，因而可認為這些品種在ALS位點上均攜帶有咪唑啉酮類除草劑敏感基因。除了 ALS627N的功能變異外，粳稻上還有研究者創(chuàng)制了ALS基因第 136位氨基酸變異后產(chǎn)生除草劑抗性的 ALS136G功能變異[14]，但是目前還未見到該功能變異在推廣粳稻品種上的應用報道，可認為本研究開發(fā)的兩個功能標記在利用金粳818的ALS627N基因培育抗除草劑新品種中具有廣泛的應用前景。

編碼氨基酸的堿基發(fā)生突變是植物對 ALS抑制劑產(chǎn)生靶標抗性的主要原因。據(jù)報道，目前在ALS蛋白中至少發(fā)現(xiàn)20個對ALS抑制劑產(chǎn)生抗性的氨基酸位點[10-14]。有意思的是，不同位點的氨基酸變異對不同類型的 ALS抑制劑類除草劑會產(chǎn)生差異性的抗藥性[24]，如第122位的氨基酸突變一般只對咪唑啉酮類產(chǎn)生抗性，對磺酸脲類、三唑并嘧啶類、嘧啶羧酸類除草劑則不太敏感；同樣，不同物種間的同一位點突變也會產(chǎn)生差異化的除草劑抗性表現(xiàn)[25-26]。因此，為了避免突變單一位點而導致長期使用同一類除草劑容易產(chǎn)生抗藥性的情況，后續(xù)有待更全面的了解水稻中的 ALS蛋白不同氨基酸位點的突變對不同 ALS抑制劑類除草劑的抗性效果和抗譜范圍。一旦獲得可靠的研究數(shù)據(jù)，即可針對不同突變位點開發(fā) ALS抑制劑類型除草劑不同專化性抗性新品種，實現(xiàn)年度間施用不同類型ALS抑制劑類除草劑，降低抗性雜草的產(chǎn)生。