鹽酸小檗堿對丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生小鼠的作用及其機制研究

盧 毅，林建喜，莫啟旺，張 曉，俞 凌，岑 斌，俞鵬奎，吳極鐘榮，鄧金平

0 引言

前列腺增生又叫良性前列腺增生(Benign proststic hyperplasia，BPH)，是一種常見的中老年男性常見疾病，目前已經(jīng)明確雄激素分泌過多是誘發(fā)前列腺增生的一個重要因素。近年來，有研究表明，前列腺增生可能和體內(nèi)炎癥因子的釋放、上皮及間質(zhì)細(xì)胞的異常增殖及前列腺組織細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的異常表達有關(guān)[1-5]。由于前列腺增生的發(fā)病機制尚不完全清楚，所以，目前對于前列腺增生的藥物治療方案尚不成熟，治療前列腺增生的特效藥物也非常有限[6]。鹽酸小檗堿具有抗炎、抗微生物、抗心律失常、抗免疫、抗腫瘤等作用[7-9]，此外，鹽酸小檗堿還具有收縮血管作用，減少組織器官充血水腫，抑制組織器官細(xì)胞異常增殖，縮小器官異常增大體積[10-12]。本試驗采用丙酸睪酮誘導(dǎo)建立前列腺增生小鼠模型，考察鹽酸小檗堿對丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生小鼠的作用，并對其機制進行研究，為鹽酸小檗堿在前列腺增生治療中的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明種小鼠40只，健康雄性，SPF級別，5～6周齡，體重(25±2)g，購買于長生生物技術(shù)有限公司，購買后進行72 h適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由進食、飲水。鹽酸小檗堿購買自天津市永大化學(xué)試劑有限公司，VEGF、AKT、caspase-12和GAPDH抗體均購自Proteintech公司，RPMI1640培養(yǎng)基、RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天公司，ECL顯色液購自Thermo公司，全自動生化分析儀購自北京島津公司，雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀、凝膠成像儀均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.2 前列腺增生小鼠模型的建立及給藥 將40只雄性小鼠皮下注射丙酸睪酮5 mg/(kg·d)，連續(xù)注射21 d進行造模，造模期間小鼠正常飲食[13]。造模成功后，將小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為模型組、鹽酸小檗堿低劑量組、鹽酸小檗堿中劑量組和鹽酸小檗堿高劑量組，模型組按照20 ml/kg灌胃給予生理鹽水，鹽酸小檗堿低、中、高劑量組按照20 ml/kg分別灌胃給予10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml的鹽酸小檗堿，所有組別每天定時給藥1次，連續(xù)給藥10 d。每天記錄各組小鼠尿量，并于最后一次給藥24 h后再次對所有小鼠進行稱重。

1.3 血漿樣品采集與處理 所有小鼠最后一次給藥24 h后，通過眼眶后靜脈叢取血至肝素潤洗過的離心管中，室溫靜置5 min，然后置于離心機中，4 ℃、3 500 r/min離心10 min。取上清液進樣至全自動生化分析儀，檢測血樣中TNF-α、IL-6、IL-10及IL-1β水平。

1.4 組織樣本采集及組織蛋白的提取并計算臟器指數(shù) 頸椎脫臼處死小鼠后迅速分離前列腺組織，用生理鹽水清洗，除去血液，濾紙吸干表面水分后稱重，計算臟器指數(shù)。然后將一部分前列腺組織放入10%中性甲醛中固定，其余部分加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，置于4 ℃離心機以12 000 r/min離心10 min，用移液槍將上清液移至另一干凈離心管中，并向其中加入上清液體積4倍的5×SDS loading buffer，混勻后放入100 ℃水浴5 min，然后放入-20 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。臟器指數(shù)按照以下公式進行計算：

1.5 蘇木精-伊紅染色(HE)染色 將在10%中性甲醛中固定24 h后的前列腺組織轉(zhuǎn)移至75%的酒精中，經(jīng)自動組織脫水機脫水、透明處理，在石蠟包埋機中浸蠟、包埋，進行5 μm切片，37 ℃水浴展開，撈片，瀝干，放45 ℃恒溫箱中烘干，置于烘箱中60 ℃烤2 h，常規(guī)HE染色，在顯微鏡下進行組織病理學(xué)觀察。HE染色步驟：①脫蠟:將石蠟切片依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min；②復(fù)水：依次置于100%乙醇2 min→95%乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸餾水洗2 min，各2次,然后把水吸干；③蘇木精染色：置于蘇木精溶液中2 min，自來水流水沖洗2 min，把水吸干；④分化：1%鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，吸干水；⑤伊紅染色:置于伊紅溶液中2 min；⑥脫水:依次置于95%乙醇(Ⅰ)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→100%乙醇(I)5 min→100%乙醇(Ⅱ)2 min；⑦封片：置于通風(fēng)櫥，待乙醇徹底干后依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min，待載玻片上殘留二甲苯揮干后用中性樹膠封片。

1.6 Western blot 將凍存的前列腺組織蛋白液于室溫下融化后，采用BCA法測定蛋白濃度，處理好待測樣品后，取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h，經(jīng)VEGF、AKT、caspase-12抗體(1∶1 000)孵育后，4 ℃過夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，進行灰度值檢測。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸小檗堿對丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生小鼠尿量及體重的影響 低、中、高3個濃度的鹽酸小檗堿連續(xù)給藥10 d后，各組小鼠累計尿量(各組小鼠10 d總尿量)及體重減輕值[體重減輕值=造模成功后小鼠體重(g)-實驗結(jié)束時小鼠體重(g)]見表1，各組小鼠每日尿量變化見圖1。結(jié)果表明，與模型組相比，鹽酸小檗堿各劑量組小鼠累計尿量顯著增加(P<0.05)，且隨著鹽酸小檗堿劑量的增加，前列腺增生小鼠累計尿量也逐漸增加，呈現(xiàn)出劑量依賴性，此外，隨著給藥時間的延長，鹽酸小檗堿各劑量組小鼠每日尿量逐漸增加，而模型組小鼠每日尿量始終在基線附近波動；同時，實驗結(jié)束時，與模型組相比，鹽酸小檗堿各劑量組小鼠的體重減輕值呈劑量依賴性顯著增加(P<0.05);提示鹽酸小檗堿能夠呈劑量依賴性地增加丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生小鼠的累計尿量，且隨著鹽酸小檗堿給藥時間的延長，前列腺增生小鼠的每日尿量也增加。

表1 各組小鼠累計尿量及體重減輕值比較(n=10)

圖1 各組小鼠每日尿量變化

2.2 鹽酸小檗堿對丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生小鼠體內(nèi)炎癥因子的影響 不同濃度的鹽酸小檗堿對模型小鼠體內(nèi)炎癥因子的影響見表2。結(jié)果表明，與模型組比較，鹽酸小檗堿各劑量組小鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-10及IL-1β等炎癥因子水平顯著降低(P<0.05)，且呈現(xiàn)出劑量依賴性，即隨著鹽酸小檗堿給藥濃度由10 mg/ml增加到40 mg/ml，前列腺增生小鼠體內(nèi)的TNF-α、IL-6、IL-10及IL-1β等炎癥因子水平也不斷降低。

表2 各組前列腺增生小鼠體內(nèi)相關(guān)炎癥因子水平比較(n=10)

2.3 鹽酸小檗堿對丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生小鼠前列腺臟器指數(shù)的影響 鹽酸小檗堿連續(xù)給藥10 d后，各組小鼠前列腺臟器指數(shù)見表3。結(jié)果表明，與模型組比較，鹽酸小檗堿能夠呈劑量依賴性地降低丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生小鼠的前列腺臟器指數(shù)(P<0.05)，降低前列腺體重占比。

2.4 鹽酸小檗堿對丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生小鼠的組織病理學(xué)的影響 模型組小鼠前列腺組織細(xì)胞形態(tài)改變，排列不整齊，細(xì)胞間隙縮小，可見結(jié)節(jié)樣增生，前列腺組織出現(xiàn)明顯鋸齒樣擴張，腺體乳頭向腔內(nèi)擴張明顯，表明丙酸睪酮誘導(dǎo)前列腺增生小鼠造模成功；與模型組比較，鹽酸小檗堿各劑量組細(xì)胞形態(tài)明顯改善，細(xì)胞排列整齊，腺體乳頭向腔內(nèi)擴張明顯縮小，鹽酸小檗堿中、高劑量組前列腺組織細(xì)胞形態(tài)圓潤，結(jié)節(jié)樣增生少見，鹽酸小檗堿高劑量組小鼠的前列腺組織腺體乳頭無異常突出，見圖2。

表3 各組前列腺增生小鼠臟器指數(shù)比較(n=10)

圖2 各組小鼠的組織病理學(xué)觀察結(jié)果(200×)

2.5 鹽酸小檗堿對前列腺增生小鼠組織中VEGF、AKT及caspase-12表達的影響 鹽酸小檗堿作用10 d后，前列腺增生模型小鼠前列腺組織中VEGF、AKT及caspase-12蛋白表達見圖3。結(jié)果表明，與模型組比較，鹽酸小檗堿各劑量組小鼠前列腺組織中VEGF及AKT表達量均顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性，而caspase-12的表達量呈劑量依賴性顯著增加(P<0.05)。上述結(jié)果提示鹽酸小檗堿能夠呈劑量依賴性地抑制丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生小鼠體內(nèi)VEGF及AKT的表達，并呈劑量依賴性地促進caspase-12的表達，表明鹽酸小檗堿對丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生小鼠的作用機制可能是抑制前列腺增生小鼠體內(nèi)VEGF的表達，從而抑制小鼠前列腺組織內(nèi)新血管的生成，造成增生細(xì)胞缺氧，同時抑制前列腺組織細(xì)胞內(nèi)AKT的表達，抑制前列腺組織細(xì)胞的異常增殖，同時促進前列腺組織細(xì)胞中凋亡蛋白caspase-12的表達，促進異常增殖細(xì)胞的凋亡。

圖3 各組前列腺增生小鼠組織中VEGF、AKT及caspase-12的表達情況

3 討論

前列腺增生是前列腺的一種非惡性的進行性生長現(xiàn)象，是老年男性最常見的泌尿系統(tǒng)疾病之一。雖然BPH-LUTS在短期內(nèi)不是威脅生命的疾病，但它們給患者的日常生活帶來了極大的尷尬和煩惱，并造成了巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[5]。

鹽酸小檗堿是小檗堿的鹽酸鹽制劑，后者是從中藥黃連中分離的一種季銨生物堿，是黃連抗菌的主要有效成分。近年來研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿能夠抑制體內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-10及IL-1β等炎癥因子的水平[7-9]，發(fā)揮其抗炎活性，在促進血管收縮的同時抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達，使作用部位細(xì)胞長期處于缺氧狀態(tài)[10-12]；此外，鹽酸小檗堿能夠抑制細(xì)胞內(nèi)AKT的表達，抑制相關(guān)靶點通路蛋白的激活，從而抑制細(xì)胞的增殖[14-15]；還能夠促進細(xì)胞中caspase-12的表達，促進細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮其抗腫瘤作用[16-18]。

本研究結(jié)果表明，鹽酸小檗堿能夠呈劑量依賴性地增加丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生小鼠的累計尿量，減少小鼠體內(nèi)尿潴留，顯著降低小鼠體重，改善小鼠病理狀態(tài)，且隨著鹽酸小檗堿給藥時間的延長，前列腺增生小鼠的每日尿量也增加；鹽酸小檗堿能夠明顯降低丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生小鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-10及IL-1β等炎癥因子的水平，改善小鼠的疾病狀態(tài)，緩解病情；還能夠呈劑量依賴性地顯著降低丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生小鼠的臟器指數(shù)，抑制前列腺增生的進展速度，改善丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生小鼠的前列腺組織的病理狀態(tài)，改善疾病轉(zhuǎn)歸，能夠?qū)σ呀?jīng)發(fā)生病理改變的前列腺組織起到一定的逆轉(zhuǎn)作用，且隨著給藥劑量的增加，其作用增強；并可能通過抑制前列腺增生小鼠體內(nèi)VEGF的表達，從而抑制小鼠前列腺組織內(nèi)新血管的生成，造成增生細(xì)胞缺氧，同時抑制前列腺組織細(xì)胞內(nèi)AKT的表達，抑制前列腺組織細(xì)胞的異常增殖，同時促進前列腺組織細(xì)胞中凋亡蛋白caspase-12的表達，促進異常增殖細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，鹽酸小檗堿能夠抑制丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生小鼠的前列腺組織的增生，其作用機制可能與調(diào)節(jié)前列腺組織中VEGF、AKT及caspase-12等蛋白的表達有關(guān)。