痰熱清注射液對產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的體外聯合殺菌活性研究

張雯霞，陳君灝，張 玨

0 引言

由于抗菌藥物長期、大量使用，細菌耐藥性逐漸增強，產超廣譜β-內酰胺酶抑制劑(ESBLs)和碳青霉烯酶的陰性桿菌的大量出現，影響了其臨床應用。產碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌已在全球各地引起廣泛的流行播散[1-4]。中國CHINET細菌耐藥監測網近10年耐藥性監測結果也顯示，臨床分離的肺炎克雷伯菌對亞胺培南或美羅培南的耐藥率上升趨勢最明顯，由2005年的2.4%快速上升至2016年的18.6%[5]。

由于CRE菌株往往對絕大多數臨床常用抗菌藥耐藥，其所致感染常伴隨高病死率，使臨床的抗感染治療面臨嚴峻的挑戰。開發能夠克服肺炎克雷伯菌耐藥治療的手段以治療日益嚴峻的CRE所致感染迫在眉睫[6]。相關研究表明，碳青霉烯類藥物聯合其他抗菌藥物治療碳青酶烯類耐藥肺炎克雷伯菌感染與單獨使用碳青酶烯類藥物治療相比，聯合治療能夠顯著改善患者預后[7]。

痰熱清注射液(TRQ)是我國廣泛應用的經典復方制劑，由黃岑、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翅5種天然草本植物水溶性提取物組成，具有化痰解痙、鎮咳平喘的功效，同時具有廣譜抗菌和免疫調節作用[8-9]，且毒副作用小[10]。本研究針對目前臨床常見的產KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，探討可用于臨床針對此類耐藥細菌所致感染的痰熱清注射液和碳青霉烯類抗生素聯合治療的新方案。

1 材料與方法

1.1 菌株 本研究選擇臨床分離的20株產KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，菌株均已通過質譜方法進行鑒定，以PCR擴增及DNA測序方法確認碳青霉烯酶基因型別。藥敏試驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 藥敏試驗 微量肉湯稀釋法測定痰熱清注射液和亞胺培南對肺炎克雷伯菌的最低抑菌濃度，實驗方法和結果判讀參考2018年版CLSI文件標準[11]。棋盤法聯合藥敏試驗方法參考文獻報道[12-13]，抑菌指數(Fractional inhibitory concentration，FIC)值的計算與判讀參考文獻標準[14]。FIC=MICA藥聯合/MICA藥單獨+MICB藥聯合/MICB藥單獨。FIC≤0.5為協同作用，0.52為拮抗作用。

1.3 聯合殺菌曲線試驗 根據聯合藥敏試驗結果，按文獻推薦方法進行聯合殺菌試驗[15-16]。操作步驟：將含1×105CFU/ml細菌的Mueller-Hinton肉湯與受試抗菌藥單藥或其聯合混合后于35 ℃大氣環境震蕩孵育，同時以無藥含1×105CFU/ml細菌的Mueller-Hinton肉湯作為生長對照。在0、2、4、6、8、10、24 h分別取樣經系列稀釋后涂布于Mueller-Hinton平板，35 ℃孵育過夜后進行菌落計數并繪制殺菌曲線圖。聯合藥物組的細菌存活數量較單藥降低 ≥ 2 log10CFU/ml判斷該兩藥組合具協同殺菌作用。

2 結果

2.1 藥敏試驗結果 20株產KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌對亞胺培南的耐藥率為100%，其MIC范圍分別為4～256 mg/L，對痰熱清注射液的MIC值為15.6～500 μl/ml。聯合藥敏試驗結果顯示，55%(11/20)的菌株對該兩藥組合呈協同作用，35%(7/20)的菌株呈相加作用，10%(2/20)的菌株為無關作用，所有菌株的聯合皆未產生拮抗作用(見表1)。

表1 20株產KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌對痰熱清注射液和亞胺培南的MIC和聯合藥敏試驗

2.2 聯合殺菌曲線試驗 選取聯合藥敏中FIC值較低的菌株K7和K17進行聯合殺菌曲線試驗，結果顯示，這2株肺炎克雷伯菌在聯合殺菌曲線試驗中亦表現為一致的聯合協同殺菌作用，菌株K7在兩藥聯合后的4 h即開始出現聯合協同殺菌效應，K17在兩藥聯合后的6 h開始出現聯合協同殺菌效應(見圖1、圖2)。在加藥10 h后，協同作用為最佳，其中菌株K7、K17聯合用藥的細菌數量較單藥痰熱清注射液和亞胺培南分別平均降低了4.6、5.4 log10CFU/ml。

圖1 肺炎克雷伯菌K7的24 h殺菌曲線圖

圖2 肺炎克雷伯菌K17的24 h殺菌曲線圖

3 討論

近年來，產碳青霉烯酶的廣泛耐藥肺炎克雷伯菌的出現給全世界健康衛生帶來嚴峻挑戰。由于缺乏有效的抗菌藥物，導致臨床治療的失敗率和病死率增加[17-18]。研究表明，碳青霉烯類藥物聯合其他抗菌藥物治療碳青酶烯類耐藥肺炎克雷伯菌感染與單獨使用碳青酶烯類藥物治療相比[7]，能夠顯著改善患者預后，如與替加環素或多黏菌素[19-21]、與阿米卡星[22]以及與磷霉素的聯合[23]等均有報道，但很少有中藥和亞胺培南的聯合治療方案。痰熱清注射液治療肺炎克雷伯菌引起的感染具有很好的療效[24-25]。對痰熱清注射液治療社區獲得性肺炎臨床療效的Meta分析發現，痰熱清注射液與抗生素聯合治療CAP比單獨使用抗生素療效更好[26]。

肺炎克雷伯菌易形成生物膜，細菌一旦形成生物膜后，相比游離狀態的細菌，細菌生物膜內的細菌對抗菌藥物的敏感性明顯降低，這是肺炎克雷伯菌易產生耐藥的主要機制之一[27-29]。有研究表明，痰熱清注射液能夠抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜的形成[30]，與阿米卡星聯合用藥后對銅綠假單胞菌耐藥菌株的生物膜生長具有抑制作用[31]。本研究通過對20株產KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌進行的中西醫聯合藥敏試驗發現，55% (11/20) 的菌株對痰熱清注射液和亞胺培南聯合呈現出協同作用，亞胺培南與痰熱清注射液聯合后，降低了亞胺培南的MIC值；部分菌株對亞胺培南單藥表現為耐藥，但與痰熱清注射液聯合后表現為敏感，如菌株K3、K12和K18。推測痰熱清注射液通過抑制肺炎克雷伯菌生物膜的形成，從而提高了亞胺培南的直接殺菌作用。

為了證實聯合藥敏的協同作用，本研究挑選了2株協同作用較好的菌株進行殺菌曲線試驗。結果顯示，殺菌曲線試驗結果與聯合藥敏試驗一致，也具有協同殺菌效應，兩株菌株在加藥4～6 h開始出現協同作用，在加藥10 h后，協同作用最佳，菌株K7和K17聯合用藥的細菌數量較單藥痰熱清注射液和亞胺培南分別降低了4.6、5.4 log10CFU/ml。但是在24 h后菌落數發生了反彈，表明細菌并沒有完全殺滅。因此，我們建議臨床上可以通過縮短用藥時間來控制感染菌的復燃。

根據體外聯合藥敏試驗及聯合殺菌曲線來選擇用藥及確定給藥時間，一方面可以獲得預期的治療效果，為臨床提供精準的治療方案；另一方面可以減少或避免單一用藥產生的細菌耐藥性。

僅依靠體外試驗結果判斷聯合用藥的協同作用具有局限性，我們要建立相關感染動物模型，探討聯合用藥方案在體內治療產KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌所致感染的有效性，觀察聯合用藥對動物感染模型的毒副作用及安全性評價，為臨床針對該類耐藥細菌所致感染提供依據。