哺乳期乳腺膿腫分離的金黃色葡萄球菌耐藥性與毒力基因研究

蔣 斕，劉婷婷，李曉勤

0 引言

哺乳期乳腺炎是哺乳期婦女乳房損傷并有細菌入侵導致的乳腺炎癥。金黃色葡萄球菌(Staphylcoccusaureus，SAU)是哺乳期乳腺炎最常見的病原菌。哺乳期婦女是一個特殊人群，幾乎所有藥物都能夠通過血漿乳汁屏障進入乳汁，故使用抗菌藥物時，應嚴格考慮對哺乳嬰兒是否有不良影響。SAU可表達多種毒力因子，如殺白細胞素(pvl)、腸毒素A(sea)、中毒性休克綜合征毒素-1(TSST-1)、表皮剝落素、溶血毒素A(hlA)、凝聚因子A(clfA)、酚溶調制肽(psm-mec)、耐熱核酸酶(nuc)、血漿凝固酶等[1]，賦予了SAU對宿主細胞的黏附性。細胞毒素和侵襲毒素賦予了SAU對宿主組織細胞的破壞性。SAU中毒力基因的高檢出率是導致乳腺炎癥的病理基礎。SAU細胞毒素基因與侵襲毒素基因高檢出率可能與創面或傷口久治不愈相關。本研究擬對我院乳腺科哺乳期乳腺膿腫患者分離的60株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和64株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)耐藥性與毒力基因進行檢測和分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 我院乳腺科哺乳期乳腺膿腫患者分離的SAU，連續收集2015年1月至2017年12月分離的MRSA 60株和MSSA 64株，使用法國梅里埃公司VITEK-2 COMPACT 全自動細菌鑒定與藥敏分析儀進行鑒定和藥物敏感性實驗。

1.2 SAU DNA模板制備 挑取純菌落置于1.5 ml Eppendorf管中，加入0.45%滅菌生理鹽水1 ml充分混勻。利用細菌基因組DNA提取試劑盒(購自天根生化科技有限公司)制備DNA模板。取適量混勻細菌液在Eppendorf管內加入20 mg/ml溶菌酶溶液200 μl，37 ℃水浴60 min，之后再70 ℃水浴14 min，12 000 r/min離心30 s，上清液為基因檢測模板液，-20 ℃冰箱保存備用。

PCR引物：根據相應文獻合成PCR引物，見表1，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

PCR擴增反應條件：預變性94 ℃，3 min。循環條件：94 ℃，30 s；55.6 ℃(mecA)、56.6 ℃(pvl)、51.8 ℃ (hla)、56.6 ℃ (clfA)、52.6 ℃ (nuc)、55.6 ℃(sea)、55.6 ℃(psm-mec)，30 s；72 ℃，1 min，循環30次；延伸72 ℃，5 min；保存于4 ℃。PCR試劑為天根生化科技有限公司產品。PCR擴增產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外儀下出現與陽性對照相同分子量的條帶為陽性。

1.3 結果判斷 按照2019年版CLSI[2]的標準判斷藥敏結果。苯唑西林的MIC值≥4 mg/L者即判斷為MRSA。

1.4 統計分析 采用WHONET 5.6 軟件對藥敏數據進行統計分析。采用SPSS 22.0統計軟件分析數據，MRSA、MSSA耐藥率以及毒力基因陽性的差異采用卡方檢驗(P<0.05)。

2 結果

2.1 MRSA組和MSSA組耐藥情況 哺乳期乳腺膿腫患者分離了60株MRSA和64株MSSA，青霉素耐藥率高(≥90.6%)，替加環素、利福平、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、萬古霉素、莫西沙星、利奈唑烷敏感率高(≥98.3%)。MRSA對克林霉素、四環素的耐藥率明顯高于MSSA，差異具有統計學意義(χ2=34.21、11.41，P<0.05)。MRSA中紅霉素耐藥率略高于MSSA，差異無統計學意義(P>0.05)。兩組環丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星耐藥率比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 PCR引物序列和擴增片段

表2 MRSA組和MSSA組耐藥情況

2.2mecA基因檢測結果 采用mecA基因的PCR引物分別對臨床分離的MRSA和MSSA菌株進行PCR擴增，結果顯示，60株MRSA均具有mecA基因的PCR擴增陽性條帶，64株MSSA均無mceA基因PCR擴增條帶。

2.3 毒力基因檢測結果 哺乳期乳腺膿腫患者中MRSA的毒力基因陽性率略低于MSSA。MSSA的pvl毒力基因表達明顯高于MRSA，差異有統計學意義(χ2=6.20，P<0.05)，見表3。

表3 MRSA組和MSSA組毒力基因攜帶情況

3 討論

哺乳期急性乳腺炎多因排乳不暢、乳汁淤積、乳頭皸裂，引起細菌感染。乳汁排出困難者需局部疏通；已形成乳腺膿腫者，需外科切開引流；配合抗菌藥物治療時，必須考慮乳汁中藥物含量及對乳兒的不良反應。若選用哺乳期禁用藥物，需考慮暫停或終止哺乳后乳汁淤積導致炎癥加重的可能。哺乳期急性乳腺炎致病菌主要為革蘭陽性菌中的SAU[3]，其致病性強，攜帶多個毒力基因，若不及時治療或治療不徹底易復發，不能為乳兒哺乳，嚴重影響產婦和乳兒的身心健康。

本研究連續收集哺乳期乳腺膿腫患者分離出的60株MRSA和64株MSSA，對青霉素和紅霉素的耐藥率較高(≥90.6%、≥59.4%)，因此，選用抗生素時，青霉素類、大環內酯類不應作為治療首選藥物。菌株對利福平、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、莫西沙星的敏感性較高(≥98.3%)，替加環素、萬古霉素和利奈唑烷未出現中介和耐藥情況。MRSA中紅霉素、克林霉素、四環素耐藥率分別為70%、53.3%、23.3%，低于相關報道(83.72%、72.09%、44.19%)[3-4]，可能與地域差異、攜帶毒力基因多少有關。MRSA對克林霉素、四環素的耐藥率均高于MSSA，這與多重耐藥特性有關。MRSA是由mecA基因介導的耐藥，此基因編碼青霉素結合蛋白(PBP)2a，與β-內酰胺類藥物的親和力下降，不能有效阻礙細胞壁肽聚糖層合成而導致耐藥。根據 2017年中國CHINET細菌耐藥監測網數據，國內 MRSA 的臨床平均檢出率為 35.3%(10.3%～62.1%)[5]，因此，應該根據藥敏結果合理使用抗生素。

SAU的定植、感染和預后與其攜帶的毒力因子有關，本研究哺乳期乳腺膿腫分離MSSA毒力因子(pvl、hla、nuc、sea)攜帶率高于MRSA，其中hla、clfA、nuc毒力因子在MSSA和MRSA中具有高攜帶率(≥98.3%)，與王俊瑞等[6]研究中hla與clfA結果一致。pvl是一種細胞外毒素，可損傷細胞膜，使細胞溶解[7]，攜帶該毒力因子的SAU毒力更強，與感染后疾病的嚴重程度相關，是區分社區獲得性及醫院獲得性感染的標志之一。本研究MRSA攜帶毒力因子pvl明顯低于MSSA(P<0.05)，與劉根焰等[8]研究結果一致。SAU可通過噬菌體溶源轉換機制獲得產pvl能力，并可能通過質粒途徑在不同菌株間水平傳播，在壞死性皮膚損害、軟組織損害等疾病中起重要作用。因此，需要關注MSSA攜帶pvl毒力因子對哺乳期不良影響。SAU細胞毒素中psm-mec與葡萄球菌感染后釋放細胞毒性因子、前炎癥因子和免疫逃逸有關[9]。psm是葡萄球菌分泌的一類多肽，具有促炎、參與免疫調節和影響生物膜形成的作用。從MRSA菌中可分離到由SCC-mec介導的同樣有psm特征的psm-mec[10]，本研究僅在MRSA中攜帶psm-mec毒力基因。nuc基因編碼的核酸酶能水解宿主細胞的核酸(含 DNA、RNA)。hla分子可插入紅細胞的細胞膜疏水區形成微孔，對多種哺乳動物的紅細胞產生溶血作用。clfA基因表達纖維蛋白原結合蛋白A，又稱為聚集毒素，均與SAU在宿主細胞中的定植能力有關[11]。nuc、hla和clfA毒力基因均在SAU中表達。

針對哺乳期發生乳腺膿腫患者，應分離病原菌，并進行藥敏檢測。對于MRSA，應加強防控和隔離治療；如果為MSSA，需監測其所攜帶的毒力基因，評估其對泌乳期宿主組織細胞的破壞和對乳兒的不良影響。