HPLC-DAD法同時測定柴黃顆粒中5種成分的含量

杜明玨，蔡建紅，錢 麗，侯劍秋

0 引言

柴黃顆粒是由柴胡藥材和黃芩提取物組成的中藥成方制劑，收錄于國家食品藥品監督管理局國家藥品標準中。柴胡退熱解郁、疏肝，黃芩清熱瀉火、燥濕解毒，二者合用在臨床上主要用于上呼吸道感染引起的感冒發熱等癥狀[1-4]。根據中藥質量標志物(Q-Mark)的概念，現代藥理研究表明，柴胡中發揮抗病毒、抗炎等作用的主要活性物質為柴胡皂苷類[5]，黃芩提取物中的黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、漢黃芩苷等主要成分具有清熱抑菌、抗炎解毒的作用[6]，與該藥的藥理作用一致。目前對于柴胡皂苷的測定[7-9]主要采用HPLC、HPLC-ELSD和HPLC-MS法。由于柴胡皂苷是末端吸收，紫外吸收弱，因此，HPLC-UV法檢測時靈敏度低、干擾大。黃芩中的幾種黃酮苷類和苷元主要是通過HPLC梯度洗脫進行測定[10-11]。目前，柴黃顆粒的質量控制只有標準中的薄層色譜法鑒別和黃芩苷的含量測定。此外，已有相關報道，包括HPLC法測定柴黃顆粒中的黃芩苷含量[12-13]，紅外光譜法建立柴黃顆粒的指紋圖譜[14]，HPLC法同時測定柴黃顆粒中柴黃皂苷a、b1、c、d及黃芩苷的含量[15]，柴黃顆粒中總皂苷的測定[16]等，尚無對該藥中黃芩提取物中多成分含量的同時測定。因此，筆者參考文獻報道[17-18]，基于黃芩在處方中的作用，擬增加黃芩提取物中的黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素以及柴胡藥材中柴胡皂苷a成分的含量測定，從而更加全面地控制柴黃顆粒的質量，為有效評價柴黃顆粒的質量提供依據。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀(美國Waters儀器公司)；Empower3 工作站；Waters2996 DAD檢測器，Mettler AE240分析電子天平(瑞士Mettler公司)；KQ-700VDB型雙頻數控超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器公司)；柴黃顆粒(河南靈佑藥業有限公司，規格：4 g/袋)，批號：180802、181103、190102，對照品：黃芩苷(批號：110715-201516，質量分數94.0%)、黃芩素(批號：111595-201608，質量分數97.9%)、漢黃芩苷(批號：112002-201602，質量分數98.5%)、漢黃芩素(批號：111514-201706，質量分數100%)、柴胡皂苷a(批號：110777-201711，質量分數91.1%)，均購于中國食品藥品檢定研究院，乙腈為色譜純(美國Merck公司)，水為超純水(美國Mili-Q超純水機)；磷酸、甲醇等均為分析純(上海國藥集團化學試劑公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Gemini-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫，0～15 min(15%～40%A)，15～25 min (40%～40%A)，25～50 min (50%～80%A)；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：280 nm (0～20 min)，210 nm (20～26 min)，280 nm (26～50 min)；進樣量：10 μl。在上述色譜條件下分別測定對照品、供試品溶液及陰性樣品溶液，色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取黃芩苷對照品10.16 mg、漢黃芩苷5.73 mg置同一50 ml容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，作為對照品儲備溶液Ⅰ；另精密稱取黃芩素9.82 mg、漢黃芩素4.58 mg置同一50 ml容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，作為對照品儲備溶液Ⅱ；精密稱取柴胡皂苷a對照品2.16 mg置10 ml容量瓶中，分別精密加入上述對照品儲備溶液Ⅰ 3 ml和對照品儲備溶液Ⅱ 1 ml，加50%甲醇稀釋至刻度作為對照品混合溶液(每1 ml含黃芩苷60.96 μg、漢黃芩苷34.38 μg、黃芩素19.64 μg、漢黃芩素9.16 μg、柴胡皂苷a 216 μg)。

2.2.2 供試品溶液的制備 取柴黃顆粒2袋，混勻研細，精密稱取上述粉末0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，稱定重量，超聲處理30 min (頻率40 kHz，功率270 W)，取出，放冷，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，用直徑0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品的制備 按照柴黃顆粒處方量的1/10，分別制備缺柴胡藥材和黃芩提取物的陰性樣品，按照“2.2”項下的供試品溶液制備方法制備。

2.3 專屬性試驗 取上述3種溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定，結果表明，陰性樣品對柴黃顆粒中5個成分的測定無干擾，見圖1。

2.4 標準曲線的測定 精密吸取上述“2.2.1”項下的對照品混合溶液1 ml，共5份，分別置100 ml、50 ml、25 ml、10 ml、2 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，分別作為1～5號系列對照品溶液，然后按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，以待測成分進樣量的質量(ng)為橫坐標、相對應的峰面積為縱坐標進行線性回歸，測定結果見表1。

表1 5種成分的線性方程、相關系數及線性范圍

2.5 精密度試驗 分別取“2.4”項下的1、3、5號系列對照品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，連續進樣6次，進樣量10 μl，記錄各成分的峰面積，計算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a的峰面積RSD分別為0.52%、0.66%、1.35%、0.83%、0.38%，結果表明，該儀器的精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取同一批號柴黃顆粒供試品溶液，分別在0、1、2、4、8、12、16、24 h進行測定，進樣量10 μl，連續考察24 h，記錄各成分的色譜峰面積，結果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a峰面積RSD分別為2.23%、2.07%、2.56%、1.25%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 取同一批號的柴黃顆粒樣品，按照“2.3”項下的方法制備6份供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，結果顯示，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、胡皂苷a的峰面積RSD分別為0.39%、1.03%、1.85%、0.68%、0.52%，表明該方法的重復性良好。

2.8 回收率試驗 精密稱取已知含量的柴黃顆粒樣品0.1 g置具塞錐形瓶中，共6份，另精密稱取黃芩苷約10 mg，共6份，分別加入上述供試品溶液中，然后精密稱取漢黃芩苷17.08 mg，黃芩素9.36 mg，漢黃芩素3.52 mg，柴胡皂苷a 2.18 mg置同一10 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，作為待加混合標準品溶液，分別精密吸取上述待加標準品溶液1 ml置上述6份供試品溶液中，然后按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進行含量測定，分別計算上述5個成分的回收率，結果見表2。

2.9 樣品的測定 取3個不同批號的柴黃顆粒樣品，按照“2.2.2”項下供試品溶液的制備，每個批號分別制備3份，按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，結果求平均值，分別計算不同批次樣品中5個成分的含量，測定結果見表3。

3 討論

3.1 供試品制備條件選擇 筆者采用不同的提取溶劑(水、50%甲醇、甲醇、5%濃氨甲醇)對柴黃顆粒樣品溶液制備方法進行考察，結果顯示，50%甲醇溶劑和水作為溶劑時，黃芩提取物中黃芩苷、漢黃芩苷的含量較高，黃芩素和漢黃芩素含量稍低，柴黃皂苷的含量在5%濃氨甲醇中含量最高，甲醇次之，最后綜合考慮采用50%甲醇溶液作為提取溶劑。本研究對不同超聲時間(10 min、30 min、60 min)和不同的超聲功率(120 W、280 W、320 W)進行考察，結果顯示，超聲時間在30 min以上、功率為320 W時各主要成分含量基本變化不大。因此，選擇50%提取溶劑、超聲時間30 min、超聲功率280 W作為供試品溶液的制備方法。

3.2 色譜條件選擇 本研究采用梯度洗脫進行多成分的測定，分別采用乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸，對流動相組成進行了考察。結果顯示，乙腈-0.1%磷酸作為流動相時，各色譜峰的分離效果優于其他流動相，基線平穩，對稱因子較高，拖尾現象減小，最后確定乙腈-0.1%磷酸作為本實驗的流動相系統。采用DAD檢測器對上述5個共有峰進行光譜掃描，結果顯示，黃芩苷在280 nm下具有最大吸收，漢黃芩苷在270 nm下具有最大吸收，黃芩素和漢黃芩素在274 nm下具有最大吸收，柴胡皂苷在208 nm下有最大吸收，因此，采用變換波長進行測定。由于黃芩苷的含量較高，且在280 nm下測定時，漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含量與其在最大吸收處幾乎沒有變化，根據最大吸收，并且參考中國藥典，選擇210 nm下測定柴胡皂苷，結果顯示，干擾較小，色譜峰形良好。因此，選擇280 nm和210 nm下進行變換波長測定，從而保證較高的靈敏度。

表2 加樣回收率結果

表3 5種成分含量測定結果(mg/g)

3.3 試驗結果分析 在配制上述對照品溶液過程中，黃芩中各種對照品不易溶解于甲醇中，尤其是黃芩苷，因其在甲醇中溶解度較低，因此，采用50%甲醇進行對照品的配制，使其快速溶解。此外，在配制各對照品溶液時，建議采用棕色量瓶，制備供試品溶液時也應該盡量避光操作，由于黃芩素不穩定，在儲存期間發生分解，因此，在制備和檢測過程應盡可能快速分析，最大程度減少黃芩素含量損失。針對黃芩中黃酮類成分酚羥基的影響，筆者在流動相中加入少量酸，對色譜峰的拖尾現象有較好的改善作用，與上述色譜條件考察一致。由于黃芩中4種主要黃酮類成分結構相似，存在相互轉換的可能，因此，原標準中僅測定黃芩苷的含量具有一定的片面性。現行標準中規定黃芩苷的含量為每袋黃芩提取物以黃芩苷含量計應為0.30～0.40 g，折合為0.075～0.10 g/g，本實驗建立的方法中，3批樣品中黃芩苷的含量均符合規定，表明該方法可以用于其含量測定。

4 總結

本文建立了HPLC-DAD法同時測定柴黃顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和柴胡皂苷a含量，比現行標準中僅通過黃芩苷的含量進行控制更能全面、有效地反映藥品的質量，且該方法經方法學驗證，具有方法簡單、專屬性強、準確度高的優點。但是該法對于處方中的柴胡成分控制依然較少。由于柴胡主要活性成分為皂苷類，紫外具有末端吸收，且干擾較大，因此，其與黃芩提取物中活性成分同時測定具有很大的困難，希望以后增加HPLC-MS/MS方法，以增加多組分含量同時測定，從而全面控制柴黃顆粒的質量。