牛乳源大腸桿菌生物被膜形成及抗生素的作用

李 芬，范玉堂，王麗娟，王寧寧，張 娟，王 妍，李勤凡

(1.新疆農業大學 動物醫學學院，烏魯木齊 830052；2.西北農林科技大學 動物醫學院，陜西楊凌 712100)

奶牛乳房炎是影響全球乳業發展的重要疾病之一，每年給養殖業造成極大的經濟損失[1]。在中國奶牛養殖中，大腸桿菌(Escherichiacoli)是引起奶牛乳房炎最重要的病原菌之一[2]。目前國內主要使用抗生素治療奶牛乳房炎，但抗生素的不合理使用導致病原菌產生耐藥性，給治療增加了難度[3]。隨著對大腸桿菌耐藥機制的研究，發現細菌耐藥與生物被膜(Biofilms,BF)的形成緊密相關[4]。

大腸桿菌易附著于物體表面形成BF[5]，BF的形成影響細菌對抗生素的敏感性，使細菌出現耐藥[6]。此外，BF對抗生素具有很強的抵抗性，一經形成就很難被徹底清除，易導致反復感染[7]。因此，如何有效突破大腸桿菌BF的保護作用殺滅細菌，對于治療產BF的大腸桿菌引起的感染非常重要。

本試驗對陜西關中地區分離的35株大腸桿菌進行BF形成能力鑒定、藥物敏感性及抗生素對BF干預作用的檢測，旨在了解奶牛乳房炎大腸桿菌BF的形成對耐藥性的影響及抗生素對BF形成的影響，為合理選擇藥物控制大腸桿菌BF的形成提供資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株及來源 35株大腸桿菌從陜西省楊凌區、華陰市、寶雞市3 個規模化奶牛場乳房炎奶牛的乳樣中分離鑒定，保存于西北農林科技大學動醫學院生物毒素實驗室，檢測其BF陽性的菌株數、BF的成分和BF的形成能力及抗生素對BF形成的作用[8]。

1.1.2 主要試劑及儀器 剛果紅、考馬斯亮藍均為Sigma公司產品；Spark多功能酶標儀為瑞士帝肯有限公司產品，熒光顯微鏡為Olympus 公司產品。

1.2 方 法

1.2.1 BF陽性菌檢測 復蘇待測菌株后，接種于LB肉湯中，37 ℃培養過夜，轉接于剛果紅瓊脂固體培養基，37 ℃培養48 h后觀察菌落顏色，黑色菌落為BF陽性菌，紅色菌落為BF陰性菌[9]。

1.2.2 BF中卷曲菌毛及胞外纖維素的檢測 參照文獻[10]，用剛果紅考馬斯亮藍固體培養基檢測菌株BF的成分，取5 μL 1.5×108CFU/mL的菌液滴加到含30 mg/mL考馬斯亮藍和40 mg/mL剛果紅的無鹽LB固體培養基中央， 28 ℃培養72 h后觀察菌落形態、顏色。

1.2.3 菌株BF形成能力檢測 參照文獻[11]的方法將BF陽性菌株接種至LB肉湯中，37 ℃培養過夜，將菌液濃度調至1.5×108CFU/mL，于96孔板中每孔加入200 μL LB肉湯和10 μL菌液，空白對照組加入210 μL LB肉湯，每株菌做5個重復，37 ℃連續培養48 h；經甲醇固定，結晶紫染色，冰乙酸脫色后，測定其OD570值。

結果判定：以空白對照組的2倍OD值作為臨界值(ODC)，根據OD570值將BF形成能力強弱分為以下幾類：OD≤ODC，不能形成BF(-)；ODC 4ODC，BF形成能力強(+++)。

根據試驗結果篩選1株強成膜能力的菌株進行后續試驗。

1.2.4 浮游菌最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度的測定 以大腸桿菌ATCC 25922作為質控菌，按照微量肉湯稀釋法測定頭孢噻呋、鏈霉素、四環素、環丙沙星、慶大霉素、青霉素這6 種抗生素的最小抑菌質量濃度(MIC)及最小殺菌質量濃度(MBC)，結果判定參照CLSI(2015)標準[12]。

1.2.5 BF菌最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度的測定 試驗菌株在96 孔板上培養48 h 形成BF后，用無菌PBS輕柔漂洗除去浮游菌，用微量肉湯二倍稀釋法倍比稀釋各個抗生素，使得各個抗生素終質量濃度依次為1.25、2.5、5、…、2 560 μg/mL，取200 μL不同質量濃度的抗生素分別加入到具有BF的96孔板中，每個質量濃度3 個重復，對照組加等量MH肉湯。結果判定：測定OD600值，培養24 h后再次測定OD600值，當培養前后的OD600值相近時判定為BF的最小抑菌質量濃度(MBIC)；將高于BF菌最小抑菌質量濃度孔中的混合液混勻，依次吸取100 μL 混合液，分別均勻涂布于LB 瓊脂培養基中，培養24 h后測定的OD600值判定為BF菌最小殺菌質量濃度(MBBC)。

1.2.6 不同質量濃度抗生素對被膜態大腸桿菌形成的抑制作用 根據上述所測得的最小抑菌質量濃度，將頭孢噻呋、鏈霉素、四環素、環丙沙星、慶大霉素、青霉素這6 種抗生素配制成1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC、8 MIC的質量濃度，96 孔板每孔加入100 μL稀釋好的菌液和100 μL配制好的不同質量濃度抗生素，空白對照組加入200 μL菌液，37 ℃培養24 h后，參照結晶紫染色法進行處理，測定其OD570值。抑制率=(空白對照組OD值-試驗組OD值)/空白對照組OD值×100%。

1.2.7 不同質量濃度抗生素對被膜態大腸桿菌BF的清除作用 在96 孔板中培養試驗菌株形成BF后，棄去殘存培養液，用無菌PBS輕柔漂洗除去浮游菌，分別取200 μL質量濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC、8 MIC的頭孢噻呋、鏈霉素、四環素、環丙沙星、慶大霉素、青霉素加入到具有BF的96孔板中，同時加入等量MH肉湯作為對照，每組3 個重復，37 ℃培養24 h，參照結晶紫染色法處理，測定其OD570值，計算清除率。清除 率=(空白對照組OD值-試驗組OD值)/空白對照組OD值×100%。

2 結果與分析

2.1 BF的形成能力檢測

結果表明，試驗株中有19株為BF陽性菌(54.29%)，16株為BF陰性菌(45.71%)(圖1)。BF陽性菌中有6株(31.58%)BF形成能力強，10株(52.63%)BF形成能力中等，3株(15.79%)BF形成能力弱。

2.2 BF中卷曲菌毛及胞外纖維素的檢測

19株BF陽性菌在剛果紅考馬斯亮藍固體培養基上可以形成4種顏色的菌落，其中紅色粗糙干燥型12株(63.16%)，表示BF同時含有卷曲菌毛和胞外纖維素；棕色干燥粗糙型1株 (5.26%)，表示BF含有卷曲菌毛；粉色干燥粗糙型2株(10.53%)，表示BF只含胞外纖維素；白色光滑型4株(21.05%)，表示BF不含胞外纖維素和卷曲菌毛；此外，BF同時含有卷曲菌毛和胞外纖維素的紅色粗糙干燥型的菌株成膜能力最強(圖2)。

2.3 BF形成前后的耐藥性

通過對大腸桿菌BF的形成時間測定，發現該形成是個動態過程，72 h內BF形成量先增加后減少，48 h時BF形成量最大，因此BF形成的最佳培養時間為48 h。

由表1可知，BF形成前，大腸桿菌對環丙沙星及頭孢噻呋這2種抗生素較敏感，對其余幾種抗生素顯示不同程度耐藥；BF形成后，大腸桿菌對這6種抗生素的最小抑菌質量濃度及最小殺菌質量濃度分別提高4～16倍、8～64倍。

A.BF陰性菌; B.BF陽性菌

A. 紅色干燥粗糙型; B. 棕色干燥粗糙型; C. 粉色干燥粗糙型; D. 白色光滑型

表1 大腸桿菌BF形成前后耐藥性的變化Table 1 Changes of drug resistance before and after BF formation in E. coli

2.4 不同質量濃度抗生素對被膜態大腸桿菌形成BF的抑制作用

抗生素質量濃度越大對BF形成的抑制率越高；在抗生素質量濃度小于MIC時，只有環丙沙星的抑制作用較明顯，其余5種抗生素的抑制作用均不明顯；當抗生素質量濃度大于MIC時，所有抗生素對BF的形成均產生明顯的抑制作用，其中頭孢噻呋及環丙沙星的抑制效果較好，鏈霉素和青霉素的效果較差(圖3)。

2.5 不同質量濃度抗生素對被膜態大腸桿菌BF的清除作用

抗生素質量濃度越大對BF的清除率越高；抗生素質量濃度為MIC時，環丙沙星和頭孢噻呋對BF的清除效果較好，青霉素和鏈霉素的清除效果較差(圖4)。

2.6 抗生素對被膜態大腸桿菌的殺滅效果

熒光染料PI可以進入死菌內發出紅色熒光，從圖5可以看出，環丙沙星、頭孢噻呋組的死菌數多，青霉素和鏈霉素組中的死菌數最少。說明環丙沙星、頭孢噻呋對被膜態大腸桿菌的殺滅效果較好。

圖3 不同抗生素對被膜態大腸桿菌的抑制作用Fig.3 Inhibition effect of different antibiotics on biofilm of E. coli

圖4 不同抗生素對被膜態大腸桿菌的清除效果Fig.4 Clear effect of different antibiotics on biofilm of E.coli

3 討 論

奶牛乳房炎是全球范圍內最常見且位居奶牛四大疾病之首的疾病[13]。大腸桿菌是常見的成膜致病菌，作為引起奶牛乳房炎的重要病原菌嚴重阻礙畜牧業的健康發展[14]。臨床上抗生素大多是針對浮游微生物的，然而環境中大腸桿菌主要以集落或者BF的形式存在，常規劑量很難起到有效作用[15-16]。

本研究對從患乳房炎的奶牛樣中分離的35株大腸桿菌BF檢測發現，BF陽性率為 54.29%，以強、中成膜能力為主(84.21%)。大腸桿菌BF的檢出率和成膜能力可能與宿主、地域、疾病類型以及用藥種類等有關。夏琦琦等[17]從水貂腸道中分離的54株致病性大腸桿菌BF陽性率為 90.70%，以強成膜能力為主(81.50%)；喻華英等[18]從犢牛糞便中分離的 60株大腸桿菌BF陽性率為15.0%，以中等成膜能力為主，僅有1株BF呈強陽性。卷曲菌毛和胞外纖維素是影響細菌在接觸面附著和BF形成能力的兩個重要表面成分，在BF形成過程中發揮特定的作用[19]。本研究對19株菌的BF成分卷曲菌毛和胞外纖維素進行檢測，發現63.16%的菌株BF同時含有卷曲菌毛和胞外纖維素，且這部分菌株BF的形成能力較強。

A. 對照組; B. 鏈霉素組; C. 頭孢噻呋組; D. 四環素組; E. 慶大霉素組; F. 青霉素組; G. 環丙沙星組

BF是導致大腸桿菌耐藥性增加的一個重要因素，BF的形成可降低其對抗生素的敏感性[3]。Tremblay等[20]研究發現，BF形成后，被膜菌較浮游菌的耐藥性提高4～2 048倍。本研究選取臨床上治療乳房炎常用的頭孢噻呋、鏈霉素、青霉素、環丙沙星、慶大霉素和四環素這6種抗生素作為試驗藥物，檢測大腸桿菌BF形成前后的耐藥性，發現大腸桿菌BF形成后6種抗生素的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度分別提高4～16倍、8～64倍。

細菌BF給醫療、環境衛生以及養殖業等許多領域帶來嚴重的危害，因此研究有效抑制BF形成的方法很有必要。本研究選擇臨床常用的6種抗生素研究其對BF的抑制作用發現，隨抗生素質量濃度的增大，對BF形成的抑制率越高，其中環丙沙星抑制效果較好，可以控制BF的早期形成，這與環丙沙星等喹諾酮類的滲透性較強有關[21]。

本研究同時進行6種抗生素對BF的清除效果和對BF內細菌的殺滅作用研究，發現環丙沙星對BF內細菌的殺滅效果和BF的清除效果最好，在質量濃度為MIC時清除率達50%以上，這與相關文獻中報道的相對高質量濃度環丙沙星可以破壞BF的結果一致[22]。本研究中，即使環丙沙星質量濃度達到4 MIC時，對BF的清除率也僅為64.9%，因此要想徹底清除BF，可以其他參考文獻報道的方法考慮聯合用藥[23-24]。