富硒葉面肥安全性評估方法建立

耿敬章，陳俊杰，楊萌，孟莉，賀博，唐德劍，楊水云*

(1.西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，陜西省營養(yǎng)與健康工程研究中心，陜西 西安 710049； 2.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部富硒產(chǎn)品開發(fā)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 安康 725000)

硒是人體必需的微量元素之一，在多種主要代謝途徑中發(fā)揮重要的作用，參與人體甲狀腺激素代謝、抗氧化防御系統(tǒng)和免疫功能[1-2]。硒缺乏會導(dǎo)致一系列嚴(yán)重疾病的發(fā)生，如癌癥、心血管疾病和炎癥等，以及其他自由基相關(guān)的問題、過早衰老等[3-12]。

硒在地殼中的分布極不均勻，因此，并不是所有地區(qū)的人們都可以僅通過地域性飲水和飲食就獲取滿足人體需求量的硒。芬蘭曾經(jīng)是一個幾乎全境缺硒的國家，政府經(jīng)過多年努力，在農(nóng)田普遍施用硒肥，才逐漸使得芬蘭人的平均硒攝人量達(dá)到了推薦標(biāo)準(zhǔn)，是一個人為改變?nèi)蔽鵂顩r的成功案例。

目前，我國市場出現(xiàn)了各種硒肥，除根內(nèi)硒肥外，還有很多速效富硒葉面肥。富硒葉面肥具有無機(jī)硒、有機(jī)硒和納米硒等多種形式，但其中所含有的硒的形態(tài)或比例，僅從外觀上是很難區(qū)分判斷的。無機(jī)硒具有較高的毒性。直接噴施無機(jī)硒將導(dǎo)致大量無機(jī)硒殘留，可能導(dǎo)致人畜食用后中毒，具有安全隱患。同時，市場上的硒肥名稱尚未加規(guī)范，許多都標(biāo)有“有機(jī)硒肥”，容易誤導(dǎo)使用者。為了建立健全監(jiān)管機(jī)制和手段，亟須建立富硒葉面肥中無機(jī)硒占比的測定和評價方法。

本研究擬采用高速離心法去除納米硒，測定上清液中的總硒，用原液總硒和上清液殘留總硒的差值即可得到納米硒占比。取除去納米硒的上清液采用沉淀和有機(jī)萃取法去除有機(jī)硒，然后測定上清液中的硒含量(即無機(jī)硒含量)，計(jì)算可得無機(jī)硒占比，以快速準(zhǔn)確地評估硒肥使用的安全性。現(xiàn)總結(jié)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以市售有機(jī)硒葉面肥作為研究對象。分析檢測中用到的三氯乙酸、NaOH、硼氫化鉀、環(huán)己烷、鹽酸、硝酸等試劑均為分析純。

硒標(biāo)準(zhǔn)液，購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1。取0.02 mL 1 mg·mL-1的硒標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液定容于100 mL，低溫保存。

1.2 儀器設(shè)備

主要設(shè)備包括：EHD-24電熱消解儀，北京東航科儀儀器有限公司；Mars6高通量密閉微波消解系統(tǒng)，美國CEM公司；LC-AFS 6500液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀，北京海光儀器有限公司；UV-8000S紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.3 溶液配制

20 g·L-1硼氫化鉀堿溶液：20 g硼氫化鉀，溶于NaOH溶液(5 g·L-1)中混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

三氯乙酸母液(300 g·L-1)，用時稀釋。

1.4 硒肥中總硒含量的測定

參照GB 5009.93—2017對硒肥原液中的總硒含量進(jìn)行測定，計(jì)為C0，單位為mg·L-1。

1.5 硒肥中納米硒含量測定

觀察所購買的富硒葉面肥發(fā)現(xiàn)，硒肥呈紅色液體且底部有紅色沉淀，推斷產(chǎn)品中含有納米硒。將富硒葉面肥溶液在13 000g的條件下高速離心10 min，去除溶液中的納米硒顆粒。矯正溶液體積等同出發(fā)溶液體積后測定無納米硒上清液中的總硒含量(C1)，則納米硒含量Cn=C0-C1，納米硒占比為(C0-C1)/C0。

1.6 硒肥中無機(jī)硒占比測定

取無納米硒的上清液，加入三氯乙酸，使其終濃度為15%，劇烈混勻，10 000g高速離心15 min，去除可能的有機(jī)硒蛋白沉淀，取蛋白上清液加入環(huán)己烷，萃取可能存在的小分子有機(jī)硒，劇烈混勻后靜置，觀察環(huán)己烷和水相之間的界面，以界面清晰狹窄為終點(diǎn)，否則需要在去除有機(jī)相后重復(fù)萃取。

收集全部水相，待定容體積與出發(fā)溶液體積一致后測定其中的總硒含量，視為無機(jī)硒含量Ci。無機(jī)硒與總硒的比值(Ci/C0)即為無機(jī)硒占比。

1.7 方法的加樣回收率與精密度測定

利用加樣回收率來衡量方法的準(zhǔn)確度。實(shí)驗(yàn)分組：一組加入標(biāo)準(zhǔn)樣和稀釋后的硒肥樣品，加樣量分別為待測硒含量的80%、100%和120%，每組實(shí)驗(yàn)平行3次；第二組直接測定稀釋后的硒肥樣品。2組待測樣品分別用上述方法測定硒含量，最終計(jì)算出回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)誤(RSD)。理論上，加樣回收率不應(yīng)低于80%。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

設(shè)置系列標(biāo)準(zhǔn)濃度(1.0～20 μg·L-1)，使用儀器自動稀釋。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)(y)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=122.68x-91.10，決定系數(shù)R2=1.000 0，可利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線測定硒肥中的硒含量。

2.2 硒肥中的總硒含量

對硒肥原液進(jìn)行稀釋度優(yōu)化，使測定結(jié)果落在工作曲線范圍內(nèi)。經(jīng)優(yōu)化，在10-4稀釋度下進(jìn)行富硒葉面肥總硒含量測定，5次測定結(jié)果的平均值為(6 004.08±21.78)mg·L-1，與其說明書標(biāo)注的總硒含量≥5 000 mg·L-1相符，測定結(jié)果的RSD為3.62%。

2.3 硒肥中的納米硒含量

取樣品稀釋度為10-4的硒肥溶液，13 000g高速離心10 min，取上清液測定C1為(2 061.40±84.00)mg·L-1，與總硒含量的差即為納米硒含量，理論計(jì)算Cn為3 942.68 mg·L-1，納米硒占比為65.67%。

2.4 硒肥中的無機(jī)硒含量

取稀釋度為10-4的樣品稀釋液，與體積分?jǐn)?shù)為30%的三氯乙酸溶液等體積混合，使三氯乙酸的終體積分?jǐn)?shù)為15%。按照前述方法去除有機(jī)硒，測得硒肥中Ci為(2 060.00±96.00)mg·L-1，6次測定結(jié)果的RSD為1.93%。計(jì)算可知，無機(jī)硒占比為34.31%。

以上測定結(jié)果表明，所測硒肥中硒形態(tài)主要是納米硒，在總硒中的占比為65.67%，無機(jī)硒占比34.31%左右，二者之和幾乎與總硒相等，同時，離心上清液采用三氯乙酸沉淀蛋白和環(huán)己烷萃取物，進(jìn)行硒含量測定，硒未檢出，說明硒肥中幾乎不含有機(jī)硒成分。

2.5 方法的加樣回收率與精密度

根據(jù)測定結(jié)果，計(jì)算加樣回收率與精密度，結(jié)果見表1。經(jīng)測算，平均加樣回收率為98.83%，RSD為1.47%，完全可滿足實(shí)驗(yàn)檢測要求，說明用此方法測定硒肥中的無機(jī)硒含量準(zhǔn)確可靠。

表1 檢測方法的加樣回收率

3 小結(jié)

市售硒肥多標(biāo)稱為有機(jī)硒肥，但其中的無機(jī)硒常占很大比例，而相對于納米硒和有機(jī)硒，無機(jī)硒毒性較高，因此，檢測硒肥中的無機(jī)硒含量對于評價硒肥安全性十分必要。采用超高速離心的方法去除納米硒，用三氯乙酸沉淀蛋白、環(huán)己烷萃取小分子有機(jī)物的方法去除有機(jī)硒，建立起一套適用于富硒葉面肥中納米硒和無機(jī)硒含量檢測的方法。經(jīng)測試，該方法的加標(biāo)回收率為98.83%，RSD為1.47%，說明所建立的方法是可信的。通過所建方法，測得市售某富硒有機(jī)肥中總硒濃度為(6 004.08±21.78) mg·L-1，與其說明一致，其中納米硒占比為65.67%，無機(jī)硒占比為34.31%，幾乎不含有機(jī)硒，可見所標(biāo)稱的有機(jī)硒肥并不是真正意義上的有機(jī)硒肥。本實(shí)驗(yàn)為硒肥中無機(jī)硒含量占比檢測提供了思路，在肥料安全性監(jiān)管和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量控制方面具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。