利用微生物防治油棕櫚莖基底感染狹長孢靈芝(Ganoderma boninense)研究

曹 旭，商 亮，李 晶，胡基華*

(1.黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱150010； 2.黑龍江省科學院高技術研究院，哈爾濱150010)

0 引言

油棕(ElaeisguineensisJacq.)原產于西非和南非，是一種四季開花結果雌雄同株多年生油料作物。棕櫚油是從非洲油棕(ElaeisguineensisJacq.)的棕果中榨取的，除了可食用之外，還是肥皂、蠟燭、化妝品和橡膠加工等非食用特性的原材料，因此油棕成為世界上最高效的產油植物，享有“世界油王”的美譽[1]。

亞洲種植油棕(ElaeisguineensisJacq.)的主要障礙之一是由狹長孢靈芝(Ganodermaboninense)引起的莖腐病，俗稱油棕莖基腐病(BSR)[2]。當莖的底部腐爛時，會在高處形成上部莖腐爛。在種植周期結束時，通常有30%～70%的油棕因莖腐爛而死亡[3]。病害發生得越來越早且造成的損害變得越來越嚴重，這些腐爛已成為制約油棕經濟的重要因素[4]，而且目前沒有任何補救措施。狹長孢靈芝(Ganodermaboninense)是一種生長在木材上的多孔真菌，屬于靈芝科、擔子菌綱[5]。它是一種降解木質素的白腐真菌[6]，以降解木材木質素成分而使白色纖維素暴露在外的能力而聞名[7]。

歷史上，BSR的控制包括文化技術(清潔、堆肥、堆砌、手術、挖溝、衛生)、機械和化學控制，這種疾病的流行主要是由于真菌在土壤中傳播，殺菌劑在到達目標之前可能就由于土壤的降解而無效[8]。而生物防治因具有對環境安全、低成本、保護植物免受病原體侵害的優勢而成為唯一選擇[9]。Suryanto研究顯示[10]，芽孢桿菌屬能夠與抗真菌化合物結合，通過真菌病原體觀察發現了協同作用、競爭營養、細胞壁裂解酶的產生和誘導的系統抗性等多種作用方式[10-11]，并證明了芽孢桿菌屬對狹長孢靈芝(Ganodermaboninense)的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

LS：Brevibacilluslaterosporu側孢芽孢桿菌。JKL：Bacilluslicheniformis地衣芽孢桿菌。CZL：Bacilluslicheniformis地衣芽孢桿菌。CZS：Bacillussubtilis枯草芽孢桿菌。CZS2：Bacillussubtilis枯草芽孢桿菌。TF28：Bacillusamyloliquefaciens解淀粉芽孢桿菌。BA：Bacillusamyloliquefaciens解淀粉芽孢桿菌。HW2：Bacillussubtilis枯草芽孢桿菌。PB12：Bacillussubtilis枯草芽孢桿菌。DDFS：Bacillussubtilis枯草芽孢桿菌。

以上菌株均為黑龍江省科學院微生物研究所自行分離獲得，保存于該所菌種保藏中心。

1.1.2 供試病樣

2015年10月-2017年1月，從馬來西亞沙巴州亞庇市沙巴大學(地處北緯1°～7°、東經97°～120°之間)的棕櫚科植物上采集狹長孢靈芝(Ganodermaboninense)樣本，編號后帶回室內進行保藏。

1.1.3 供試培養基

馬鈴薯瓊脂培養基(PDA)：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，水1 L，pH 7.0。馬鈴薯培養基(PD)：馬鈴薯200 g，水1 L，pH 7.0。細菌培養基(NYD)：牛肉膏8 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，水1 L，pH 7.2～7.5。

1.2 方法

1.2.1 固體培養條件下的拮抗作用測定

對實驗室現有保藏的生防菌株(CZL、CZS、CZS2、PB12、JKL、LS、TF28、BA、HW2、DDFS) 挑取單菌落，分別接于5 mL NYD試管中，于35℃、170 r/min 振蕩培養18 h，測定菌數后用無菌水稀釋至2×108cfu/mL備用。將保存在斜面上的狹長孢靈芝(Ganodermaboninense)接PDA平板，置于29℃培養箱中進行培養至菌絲長滿培養皿。在PDA培養基平板一側接入直徑為8 mm的靶標病原菌菌餅后，在對側等距離位置上分別劃線待測生防菌液。設無生防菌液為對照，3次重復，于29℃下培養，當對照真菌長至劃線位置時觀察處理組的抑菌效果。抑菌率= (對照菌絲直徑-處理菌絲直徑)/對照菌絲直徑×100%。

1.2.2 液體培養條件下的拮抗作用測定

在50 mL NYD液體培養瓶中以2%的接種量分別加入同樣稀釋倍數的7株生防菌液，再于每瓶中分別接入直徑為8 mm的靶標病原菌狹長孢靈芝(Ganodermaboninense)菌餅，同時設未接種生防菌液為對照，3次重復，置于29℃、150 r/min恒溫搖床上震蕩培養。每天對真菌生長情況進行觀察，到第5 d停止培養，將菌絲過濾，置于陰涼干燥處晾干后稱其干重并計算抑菌率。抑菌率=(對照菌絲重量-處理菌絲重量)/對照菌絲重量×100%。

2 結果與分析

2.1 固體培養條件下狹長孢靈芝(Ganoderma boninense)的拮抗作用測定

通過平板抑菌對峙試驗對10株生防菌株的抑菌能力進行測定(如圖1所示)。篩選出8 株有抑菌能力的菌株(如圖2A所示)，其中，菌株PB12和HW2的抑菌效果較明顯。通過對抑菌帶寬度進行測量可知，菌株PB12的抑菌率為68.57%，菌株CZS的抑菌率為64.08%(如圖2B所示)。將抑菌效果大于50%的7株生防菌進行純化保藏。

圖1 各生防菌株活菌計數值Fig.1 Values of viable bacteria of each biocontrol strain

圖2 固體培養時生防菌株對狹長孢靈芝(Ganoderma boninense)的拮抗作用Fig.2 Antagonistic effect of biocontrol strains on Ganoderma boninense

2.2 液體培養條件下狹長孢靈芝(Ganoderma boninense)的拮抗作用

通過共培養的方法對7株生防菌的拮抗作用進行測定，結果表明，在液體培養條件下，對照組中狹長孢靈芝(Ganodermaboninense)菌絲迅速生長成團塊，而加有生防菌株的培養瓶內菌絲生長緩慢，直到第5 d時停止培養，將各組菌絲進行過濾、晾干、稱重。對照組菌絲團塊明顯大于各試驗組菌絲團塊(如圖3AB所示)。通過計算各組菌絲團塊的重量表明，7株菌株均能夠抑制狹長孢靈芝(Ganodermaboninense)菌絲的生長，其中菌株CZS的抑菌效果最好，抑菌率達到96.47%(如圖3所示)。

圖3 液體培養時狹長孢靈芝(Ganoderma boninense)拮抗菌株的拮抗作用Fig.3 Antagonistic strains of Ganoderma lucidum in liquid culture

3 結論與討論

生防菌的拮抗能力是影響其生防效果的重要因素。受自身特性與所處環境等因素影響，研究生防菌的生防效果是評價其是否具有應用前景的重要指標之一[2]。本試驗利用已知生防菌株研究馬來西亞油棕致病菌狹長孢靈芝(Ganodermaboninense)離體條件下相互拮抗的作用(今后尚需進行田間試驗研究)，以揭示油棕、狹長孢靈芝(Ganodermaboninense)、生防菌三者之間的互作關系，進而為馬來西亞油棕園的生態健康提供理論和技術支撐。

生防菌株所處環境是影響生防菌拮抗能力的主要因素。研究發現，生防菌在PD液體培養條件下對狹長孢靈芝(Ganodermaboninense)的抑制作用遠高于其在PDA固體的培養條件下，說明生防菌株在PD液體培養時，生防細菌可以充分同病原菌菌絲體接觸并作用，使其達到最優的拮抗效果。但馬來西亞位于赤道附近，屬于熱帶地區，常年氣溫較高且雨季時濕度較大，所篩生防菌在高溫環境下的活體植株上能否正常發揮抑制病原菌的作用都是未知數，還需要后續試驗來驗證其功效，以早日解決東南亞地區的油棕病害，為帶動當地經濟發展作出貢獻。