甲狀腺乳頭狀癌合并橋本甲狀腺炎中BRAF V600E蛋白的表達及臨床意義

馬東林，樸穎實，毛美玲，曹丁方，劉紅剛

橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis, HT)是一種自身免疫性疾病，臨床表現為甲狀腺功能紊亂，病理可見大量淋巴細胞和漿細胞浸潤，并可形成淋巴濾泡。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是甲狀腺常見的惡性上皮腫瘤，有文獻指出與PTC合并其他甲狀腺良性腫瘤的共檢率相比，PTC合并HT的共檢率更高(10%～58%)[1]，但相關作用機制仍需進一步研究。BRAF V600E突變是PTC的常見驅動突變[2]，突變率為45%～80%，但在HT中較少發生。PTC合并HT時是否會影響BRAF的突變率，以及是否會對臨床病理特征產生影響目前尚不明確。BRAF V600E突變蛋白為BRAF V600E基因突變后表達的蛋白，目前鮮有人通過分析BRAF V600E突變蛋白的表達情況來研究其對PTC合并HT臨床病理特征的影響。本實驗旨在通過檢測PTC合并HT中BRAF V600E蛋白的表達情況，結合臨床病理特征，分析BRAF V600E蛋白表達與HT和PTC之間可能存在的臨床病理關系，以期對其致病機制、疾病預后等方面的研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年1月～2019年7月首都醫科大學附屬北京同仁醫院行甲狀腺半葉/全切除手術伴中央區淋巴結清掃且有完整臨床病理資料的465例經典型PTC，其中139例為PTC合并HT，326例為無HT合并的單純PTC。

1.2 主要試劑BRFA V600E蛋白抗體(RM8，貨號ZA-0668，北京中杉金橋公司)；通用型兩步法檢測試劑盒(PV 9000，北京中杉金橋公司)。

1.3 方法手術切除標本經10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋后，制成4 μm厚切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗后，PBS沖洗3遍，EDTA(pH 8.0)高壓蒸汽修復2.5 min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3遍后，采用免疫組化EnVision兩步法檢測。BRFA V600E蛋白抗體孵育溫度及時間為37 ℃ 40 min。用已知陽性組織切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 判定標準BRAF V600E抗體陽性染色定位于細胞質，結果判定同時參考染色強度(0～3+)和陽性百分比(0～100%)兩個指標，腫瘤細胞陽性百分比≥20%且染色強度為2+以上時，定義為陽性。

1.5 統計學方法采用SPSS 18.0軟件進行統計學處理，均數之間比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，Logistic回歸分析用于分析是否合并HT時PTC臨床病理特征的相關危險因素，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTC中HT與臨床病理特征的關系入組465例PTC中，PTC合并HT組139例，無HT合并的單純PTC組326例。PTC患者平均發病年齡42.86歲，<55歲組占比81.08%，女性占比73.98%，腫瘤直徑≤1 cm占比59.78%，腫瘤多發占比34.84%，中央區淋巴結出現轉移占比54.41%。HT在PTC中的共檢率為29.89%，與單純PTC組相比，PTC合并HT組女性發病率更高(88.49%vs67.79%，P<0.001)；PTC中HT與發病年齡、腫瘤大小、腫瘤多發及中央區淋巴結轉移均無關(P>0.05，表1)。

2.2 PTC中BRAF V600E蛋白的表達BRAF V600E蛋白陽性染色定位于細胞質(圖1)，465例PTC中BRAF V600E蛋白的陽性率為66.88%，PTC合并HT組的BRAF V600E蛋白陽性率較單純PTC組低(59.71%vs69.94%)，差異有統計學意義(P=0.032，表2)。

表1 PTC中HT與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 多元Logistic回歸分析HT與PTC的相關危險因素多元Logistic回歸分析PTC中HT與發病年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤多發、中央區淋巴結轉移、BRAF V600E蛋白表達的相關危險因素，結果顯示HT與女性成正相關(OR=3.897，95%CI：2.182～6.960)，與BRAF V600E蛋白陽性呈負相關(OR=0.605，95%CI：0.393～0.930)，與發病年齡、腫瘤大小、腫瘤多發、中央區淋巴結轉移無關(表3)。

HE染色BRAFV600E陽性HE染色BRAFV600E陰性PTC合并HT單純PTC

表2 PTC中BRAF V600E蛋白的表達情況[n(%)]

表3 多元Logistic回歸分析橋本甲狀腺炎與甲狀腺乳頭狀癌的相關危險因素

2.4 PTC中HT和BRAF V600E蛋白與臨床病理特征的關系將PTC病例按是否存在HT和BRAF V600E突變蛋白分為四組，分別標記為HT+BRAF V600E+、HT+BRAF V600E-、HT-BRAF V600E+、HT-BRAF V600E-，分別對不同組的臨床病理參數進行統計學分析。HT+BRAF V600E-組發病年齡較小(38.88歲)，在<55歲患者占比也較高(92.86%)，與其他組相比差異均有統計學意義(P均<0.05)；四組相比，無論BRAF V600E蛋白是否表達，合并HT的女性患病率均明顯高于男性；HT或BRAF V600E蛋白表達均與腫瘤大小、腫瘤多發、中央區淋巴結轉移無關(表4)。

3 討論

HT和PTC共存的流行病學和病因學研究一直是學者們研究的熱點，但目前尚未得出一致的結論[3]。Molnár等[4]認為HT是促進甲狀腺腫瘤發生的一種癌前狀態。發生HT時，慢性炎癥導致的免疫反應通過與周圍基質細胞持續作用，可改變腫瘤微環境，最終造成基因改變、細胞增殖異常，向PTC轉化[5]。HT患者血清中促甲狀腺激素水平升高，刺激甲狀腺濾泡細胞分化，也可能促進PTC的發生[6]。為進一步研究HT和PTC之間的臨床病理關系，本實驗收集465例PTC，根據是否合并HT分為兩組，以評估HT對PTC臨床病理特征的影響。本實驗中HT在PTC中的發生率為29.89%，與文獻報道10%～58%的共檢率相符[1]。有實驗表明HT對PTC進展起保護性作用，合并HT的PTC患者淋巴結轉移較少見[7]，但本實驗結果卻顯示HT與淋巴結轉移無關，僅與患者性別及BRAF V600E蛋白表達相關，與腫瘤大小、腫瘤多發也無關。該結果與Kim等[1,8]的研究結果相同。實驗結果不同可能與實驗對象人群所處的地理環境不同以及HT的判斷標準不一致等因素有關。Lee等[9]的研究中判斷HT時除病理學指標外同時加入了血清學指標甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody, TPOAb)，當TPOAb陽性時，PTC中出現彌漫性淋巴細胞浸潤才預示腫瘤侵襲性較弱。本實驗并未檢測血清中TPOAb水平，僅通過鏡檢見大量淋巴細胞和漿細胞浸潤、淋巴濾泡形成作為HT的病理學診斷依據。

表4 PTC中HT和BRAF V600E蛋白與臨床病理特征的關系[n(%)]

BRAF V600E突變是PTC的常見驅動突變，發生率為45%～80%。BRAF突變抗體在PTC中的應用較廣泛，免疫組化檢測突變特異性BRAF V600E蛋白與Real-time PCR、測序法等檢測核酸突變有較高的一致性。本實驗使用克隆號為RM8的BRAF V600E抗體，該抗體可與BRAF V600E突變體反應，與野生型BRAF無交叉反應。該抗體與熒光定量PCR檢測BRAF基因突變相比，敏感性為92%，特異性為92.6%，有較高的一致性。與克隆號為VE1的BRAF V600E抗體所報道的敏感性和特異性相似(89%～100%，61.5%～100%)[10-11]。目前，研究BRAF V600E突變蛋白表達在單純PTC及PTC合并HT中的臨床意義較少，核酸水平與蛋白水平的改變對臨床病理特征的影響是否一致，需進一步探討。有研究指出BRAF V600E突變可以作為PTC復發的獨立預測因子，并與結外轉移、淋巴結轉移、TNM分期高等預后不良因素有關[12]。HT中很少有報道檢測出BRAF突變，Sadow等[13]在28例HT中均未檢測出BRAF突變，Tennakoon等[14]也認為HT中BRAF突變較低，可通過檢測BRAF基因突變情況對HT或PTC進行區分。大部分研究指出PTC合并HT中可檢測出BRAF突變，但突變率較單純PTC低，本實驗中PTC合并HT的BRAF V600E蛋白陽性率低于單純PTC組(59.71%vs69.94%，P=0.032)，與分子水平檢測結論一致。但在PTC合并HT中，BRAF突變對預后的影響仍存在爭議。發病年齡為甲狀腺腫瘤TNM分期的關鍵因素，<55歲患者即使出現淋巴結轉移和遠處轉移也被分為Ⅱ期，預后較好。本實驗中PTC合并HT組中BRAF V600E蛋白陰性組的發病年齡比BRAF V600E蛋白陽性組的發病年齡小(38.88歲vs43.54歲，P=0.019)且<55歲患者年齡占比高(92.86%vs75.90%，P=0.009)，可能提示BRAF V600E蛋白陰性組的預后好于陽性組。目前PTC合并HT的相關文獻中研究BRAF V600E突變對臨床病理特征的影響多是在分子水平檢測核酸的變化來判定BRAF基因突變。如Dong等[15]的一項研究指出PTC合并HT中如出現BRAF V600E突變則提示為腫瘤多發的指標之一；Zeng等[16-17]均認為PTC合并HT中即使發生了BRAF V600E突變，與單純PTC相比其淋巴結轉移率低，為PTC的保護性因素。本實驗在蛋白水平檢測BRAF V600E突變蛋白的表達，并未發現BRAF V600E蛋白表達與腫瘤多發和中央區淋巴結轉移有關。是否由于PTC合并HT中BRAF V600E突變率較低而使HT成為PTC的保護性因素，仍需進一步探討。PTC合并HT中還存在RET/PTC原癌基因重排、PI3K/Akt通路激活等，HT和BRAF與這些通路之間有無共同影響也需進行進一步的探討。

總之，本實驗首次通過直接分析BRAF V600E突變蛋白的表達情況，探討其對PTC合并HT臨床病理特征的影響，結果表明與單純PTC患者相比，PTC合并HT患者BRAF V600E蛋白的陽性率低；HT或BRAF V600E蛋白表達均與腫瘤大小、腫瘤多發、中央區淋巴結轉移無關。后續將進一步在分子水平研究PTC合并HT中BRAF V600E蛋白同其他分子通路的關系，以期闡明PTC與HT共存的分子機制，為指導診治提供理論支持。