基于SSR 標記的油橄欖主要栽培品種子代父本分析

邵文豪，王兆山，張建國＊

(1.中國林業科學研究院林業研究所，國家林業和草原局林木培育重點實驗室，林木遺傳育種國家重點實驗室，北京 100091；2.中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，浙江 杭州 311400)

油橄欖（Olea europaea L.）為木犀科（Oleaceae）木犀欖屬（Olea L.）常綠喬木，是世界著名木本油料樹種，主要分布于地中海地區，由其新鮮初熟或成熟果實冷榨而成的橄欖油，富含單不飽和脂肪酸和抗氧化物質，營養和保健功能越來越受到人們的認可[1-2]。

油橄欖為風?異花授粉，不同品種自交和雜交親和性仍沒有得到充分地研究和揭示，如對栽培品種“Moraiolo”和“Manzanillo”自交親和性的研究，不同學者得出的結論完全相反[3]。Mekuria 等[4]認為，實驗條件不同甚至參試品種鑒定不準確或名稱混淆，自交親和性的研究都有可能出現截然不同的結果。人工套袋授粉，顯微觀察花粉管萌發、生長，統計坐果率，是油橄欖品種親和性研究的常規方法[5-6]，但這種方法很難避免外來花粉污染[7]，袋內微環境的改變及果實自然脫落都會影響對套袋真實坐果率的判斷[8]。采用分子標記方法進行親和性分析準確性較高，其中，SSR 標記具有共顯性、高多態性的特點，在油橄欖遺傳學研究中得到廣泛應用[3,9-13]。

20 世紀50 年代以來，我國自國外引種油橄欖品種150 多個，在甘肅、四川、重慶、云南等地推廣種植，目前栽培面積近11 萬hm2，經濟、生態和社會效益顯著；然而，我國早期營建的很多油橄欖品種園缺乏明確的授粉品種配置技術，坐果率低、掛果少、產量低等現象較為普遍。甘肅武都油橄欖品種園是我國收集保存油橄欖種質資源較豐富的品種園，本研究以該品種園收集保存的114 份油橄欖種質作為候選父本，選擇園內4 個主要栽培品種，利用SSR 標記對品種子代的真實父本進行鑒定，分析品種親和性，探索適宜的授粉品種，以期為油橄欖品種園中品種配置提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘肅省隴南市武都地區自1978 年開始引種油橄欖，1992 年建立近7 hm2油橄欖豐產示范園[14]。目前，武都油橄欖品種園已收集、保存油橄欖種質114 份（114 份種質信息表略），包括油橄欖亞種尖葉木犀欖（O.europaea subsp.cuspidata (Wall.ex G.Don) Cif.）和變種金葉木犀欖（O.europaea subsp.cuspidata var.chrysophylla Lam.）。

品種園內不同種質材料混合種植，株行距約3 m×3 m，植株長勢良好。選擇“城固32”（“Chenggu 32”）、“豆果”（“Arbequina”）、“賀吉布蘭克”（“Hojiblanca”）和“皮瓜爾”（“Picual”）4 個主要栽培品種，于果實成熟期分別從不同品種植株中部的4 個方位，隨機采摘新鮮果實5 顆以上，其中，“城固32”30 顆，“豆果”25 顆，“賀吉布蘭克”20 顆，“皮瓜爾”20 顆。用自封袋將果實分裝帶回實驗室，果肉自然軟化后，去除果皮，剝出的種子保存在4℃冰箱中備用。

從每份種質的正常結實植株上采集新鮮葉片，立即裝在樣品袋中進行硅膠干燥，帶回實驗室于4℃冰箱中儲藏備用。樣品采集時，詳細登記每份種質的原始名稱、原產地和引種地等信息。原始記錄名稱缺失或不確定的27 份種質，采用UC1、UC2、UC3、 ···、UC27 進行編號。

材料標本憑證保存于中國林業科學研究院林業研究所國家林業和草原局林木培育重點實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取 葉片DNA 提?。豪锰旄萍迹ū本┯邢薰旧a的植物基因組DNA 提取試劑盒（DP305）提取油橄欖葉片全基因組DNA，操作參照說明書。

種胚DNA 提?。菏褂猛頓NA 提取試劑盒，按照產品說明向GP1 緩沖液中加入定量的β-巰基乙醇，65℃水浴備用。將油橄欖種子從硬質內果皮中剝離出，浸泡于65℃水中，去除種皮和胚乳，切取1/2 種胚置于1.5 mL 離心管中，加入約300 μL 備用GP1 緩沖液，利用TIANGENOSEY30 高速組織研磨器研磨至樣品完全粉碎，再向研磨樣品加入備用GP1 緩沖液約400 μL，輕搖混勻，置于65℃水浴鍋中水浴40～60 min，期間每10 min 取出重新混勻，后續操作參照說明書。

1.2.2 引物合成 14 對SSR 引物根據文獻[15-19]中記載的序列信息，由生工生物工程（上海）股份有限公司提供合成服務，其中，5′端分別用6-FAM、HEX、TMR 和ROX 熒光進行標記（表1）。

1.2.3 PCR 擴增測序 PCR 擴增采用20 μL 反應體系，包括7.9 μL ddH2O，10 μL PCR Mix（含DNA polymerase、dNTPs 和Buffer），正反向引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，以 及0.5 ng 模 板DNA。擴增程序：94℃預變性，4 min；94℃變性30 s，60℃左右退火30 s，72℃延伸2 min，10 個循環；94℃變性30 s，55℃左右退火30 s，72℃延伸2 min，26 個循環；72℃延伸10 min；10℃保存。退火溫度因引物不同而異。使用ABI Veriti96 PCR 儀進行PCR 擴增，產物送北京擎科新業有限公司進行Sanger 法測序。

1.2.4 數據處理 采用GeneMapper 4.0 軟件（Applied Biosystems, Warrington, United Kingdom），按照使用說明書，設置參數，進行基因分型。分型的結果以Excel 表格輸出。

建立母本、候選父本（葉片）和子代（種胚）基因型數據庫，使用Cervus 3.0 軟件計算等位基因頻率、期望雜合度、觀測雜合度、多態信息含量、啞等位基因以及非父排除概率等參數[20-21]。運行Simulation 程序中的paternity 子程序，輸入等位基因頻率分析文件，模擬10 000 次親子鑒定。運行Parentage Analysis 程序中的paternity 子程序，輸入子代及候選父本基因型文件、等位基因頻率分析和模擬分析文件，計算候選父本基因型似然對數比（LOD）值和不同置信水平（80%和95%）Delta值（最大和次大LOD 值的差值），根據LOD 值大小判定親子關系。

2 結果與分析

2.1 油橄欖品種種子發育及種胚獲取

4 個油橄欖品種共采集果實95 顆，種子敗育現象在品種間普遍存在，“豆果”種子發育正常果實比例最高（96%），“賀吉布蘭克”最低（70%）（表2）。

表1 14 對SSR 引物序列信息Table 1 Sequence information of the 14 SSR markers

油橄欖種子發育過程中，2 個心皮內分別著生2 個胚珠[22]，后期通常只有1 個胚珠發育成為種子[23]。通過對不同品種種子解剖發現，“城固32”和“賀吉布蘭克”果實內具有2 粒發育正常種子的現象（圖1），其中,“賀吉布蘭克”果實具2 粒發育正常種子的比例達25%（表2）。

4 個品種共獲得88 粒發育正常的種子，具2 粒發育正常種子的僅取其中1 粒，共剝離出80 個種胚用于父本鑒定分析。

2.2 父本鑒定參數檢測

2.2.1 等位基因頻率 14 個SSR 位點的平均等位基因數16.1 個（表3），其中，DCA9 位點上的等位基因數目最多（29 個），GAPU59 位點上等位基因數目最少（8 個），均滿足利用SSR 標記進行父本分析所需等位基因數要求[24]。UDO99-019 位點132 bp 的等位基因頻率最高（0.645 9），而GAPU101 位點194、216、245 和247 bp 的等位基因頻率最低，均為0.002 6。

2.2.2 平均雜合度 14 個SSR 位點的觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）均值分別為0.788 0和0.786 3，變異范圍分別為0.514 0～0.995 0 和0.551 0～0.926 0（表4）。Ho 和He 均值相近，表明油橄欖品種受選擇及近交等因素的影響較??；平均雜合度較高，表明油橄欖品種遺傳變異大，環境適應能力強。

表2 油橄欖不同品種果實種子發育情況Table 2 Seed development of different olive cultivars

圖1 油橄欖不同品種種子發育比較Fig.1 Comparison of seed development between different olive cultivars

2.2.3 多態信息含量及排除概率 通常認為，多態信息含量（PIC）＞0.500 0 時位點為高度多態，0.250 0＜PIC＜0.500 0 時位點為中度多態，PIC＜0.250 0 時則為低度多態位點[25]。14 個SSR 位點的PIC 值均大于0.500 0（表4），均為高度多態位點。平均多態信息含量為0.758 8，其中，UDO99-019 位點最低（0.520 0），GAPU103 位點最高（0.918 0）。14 個SSR 位點具有豐富的多態性，能夠為研究提供足夠的多態信息。

當雙親基因型皆未知時，單個SSR 位點的非父排除概率（NE-1P）變化范圍為0.268～0.827，均值0.550；當一個親本基因型已知時，單個SSR 位點的非父排除概率（NE-2P）變化范圍為0.155～0.664，均值0.387；當雙親基因型已知時，單個SSR 位點的非父排除概率（NE-PP）變化范圍為0.040～0.504，均值0.212（表5）。

依據PIC 值由高至低依次累積計算14 個SSR 位點的排除概率，隨著SSR 位點數增加，累積排除概率增大（圖2）。對于單親已知類NE-2P，基于前9 個SSR 位點累積排除概率0.958，基于前12 個SSR 位點累積排除概率0.994，而基于全部14 個SSR 位點累積排除概率高達0.999。

2.2.4 啞等位基因頻率 啞等位基因影響遺傳分析結果，數據處理時需要將啞等位基因頻率偏高的位點刪除[26]。對14 個SSR 位點啞等位基因的檢測結果表明，各位點均存在一定的啞等位基因，但頻率較低，均小于0.080 0（表4），可用于親本鑒定分析[26]。

2.3 父本鑒定

在置信度80%水平，4 個品種共計29 個子代鑒定出候選父本（表6），其中“城固32”13 個（鑒定率50%），“豆果”7 個（鑒定率29%），“賀吉布蘭克”5 個（鑒定率36%），“皮瓜爾”4 個（鑒定率25%）。

在置信度95%水平，“城固32”、“豆果”和“皮瓜爾”子代主要候選父本分別為“豆果”（占60%）、“小蘋果”（占67%）以及“豆果”（占100%），而“賀吉布蘭克”子代鑒定出的候選父本僅1 個，為“小蘋果·塞維利亞”。

表5 14 個SSR 位點的非父排除概率Table 5 Non-exclusion probability of the 14 SSR loci

圖2 14 個SSR 位點的累積排除概率Fig.2 Combined exclusion probability of the 14 SSR loci

3 討論

多態信息含量（PIC）是衡量基因豐富度的重要指標，等位基因越多，多態性越豐富。本研究中,14 個SSR 位點PIC 均值0.758 8，多態性高，啞等位基因頻率檢測結果也表明各SSR 位點可用于油橄欖品種子代的父本分析?；谶z傳排除法（Genetic exclusion）[27]和Cervus 3.0 軟件[28-30]，利用這14 個SSR 標記對我國甘肅武都油橄欖品種園“城固32”、“豆果”、“賀吉布蘭克”以及“皮瓜爾”4 個主要栽培品種子代進行父本分析，檢測各子代與候選父本之間的親緣關系，在單親基因型已知下，累積排除概率高達99%，可認為候選父本和子代間的親子關系成立。通過比較子代、母本和候選父本的基因型，計算每個候選父本的LOD 值，從候選父本中為部分子代鑒定出真實親本。

對油橄欖4 個品種80 個子代父本分析結果表明，在80%置信水平可為29 個子代確定候選父本，即花粉來源，鑒定率與其他學者對油松（Pinus tabulaeformis Carr.）[31]、馬 尾 松（P.massoniana Lamb.）[32]、青岡（Cyclobalanopsis glauca (Thunb.)Oerst.）[33]等樹種的研究結果相似。

4 個油橄欖品種的子代檢測出的候選父本相對集中，共14 個品種，僅占全部候選父本的12%，表明品種園內僅有少數品種的花粉對子代的貢獻較大。何田華等[34]認為,利用排除法進行親本分析時，群體中候選親本數量不宜大于100，否則很難為大多數子代確定親本來源。本研究中,候選父本多達114 個，這可能是只有少部分子代的父本被鑒定出的原因之一，而不同品種間的花期同步性、品種園內小區塊的品種配置等因素可能也會影響對子代花粉來源的分析和鑒定，需要在今后研究中予以關注。

油橄欖多數品種存在自交不親和現象[4]，對品種自交親和性和品種間雜交親和性的研究結果受環境條件等因素的影響[35]。本研究中，4 個油橄欖品種僅在“城固32”子代中檢測到來自品種自身的花粉，表明“城固32”具有自交親和性，王笑山等[36]對陜西城固油橄欖園主要品種自花授粉坐果率的研究也表明“城固32”具有一定的自交結實能力?！岸构薄ⅰ百R吉布蘭克”和“皮瓜爾”子代沒有檢測到品種自身花粉，為自交不親和品種。其它學者對我國四川涼山州[13]、意大利西西里島[35,37]油橄欖品種親和性的研究結果也表明“豆果”自交不親和。

“城固32”子代候選父本60%為“豆果”（置信度95%），表明“豆果”是其主要的花粉貢獻品種。同時，在“豆果”子代候選父本中檢測出“城固32”（置信度95%），表明這2 個品種可互相作為授粉品種，這與對四川涼山州油橄欖品種適配性的研究結果一致[13]。此外，在“豆果”和“賀吉布蘭克”的子代候選父本中，“小蘋果”的比例分別為57%和40%（置信度80%及95%），表明可以將“小蘋果”作為“豆果”和“賀吉布蘭克”建園的共同授粉品種。另外，“賀吉布蘭克”子代候選父本中檢測出油橄欖變種金葉木犀欖（置信度80%），表明以金葉木犀欖為父本，對“賀吉布蘭克”實施雜交制種和遺傳改良具有可行性。

表6 油橄欖4 個品種子代父本分析結果Table 6 Paternity analysis result of the four olive cultivars progenies

研究發現“城固32”和“賀吉布蘭克”果實內具有2 粒發育正常的種子，且在后者果實中的比例達25%，而“豆果”和“皮瓜爾”果實內僅有1 粒發育正常的種子。Cuevas 等[23]研究表明，“賀吉布蘭克”果實（14%）中同樣具有2 粒發育正常的種子，“皮瓜爾”中沒有此現象，但在“豆果”中發現了少量果實（4%）具2 粒發育正常的種子。Farinelli等[37]研究表明，在一些油橄欖品種中，具2 粒發育正常種子的果實比僅2 粒種子的果實大。因此，今后應加強對果實具2 粒發育正常種子品種的研究，比較具2 粒種子與1 粒種子果實的表型差異，通過父本分析確定花粉來源，繼而探索授粉品種對油橄欖果實種子發育的影響。

4 結論

本研究將我國甘肅武都油橄欖品種園114 份種質作為候選父本，利用14 個SSR 標記對園內4 個主要栽培品種“城固32”、“豆果”、“賀吉布蘭克”和“皮瓜爾”的子代進行父本分析，結果表明14 個SSR 位點均為高多態性位點，對于單親已知類NE-2P，其累積排除概率高達0.999，這為油橄欖品種子代父本鑒定提供了重要的遺傳標記選擇。經檢測，“城固32”和“皮瓜爾”子代的主要父本為“豆果”，而“豆果”和“賀吉布蘭克”子代的主要父本為“小蘋果”，同時，4 個品種僅“城固32”具有一定的自交親和性，這為今后油橄欖建園時的品種配置設計提供了基礎依據。