恒清Ⅰ號方對血管性癡呆大鼠學習記憶能力的保護作用研究

孟勝喜，霍清萍，王 兵，彭文波，王宇新，梁 芳，汪天湛，張洪艷，余忠海，彭學豐，李學敏，曹健美，李文濤

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是出血性腦病、缺血性腦病等腦血管疾病引起的認知功能障礙綜合征，VD是僅次于阿爾茨海默病引起老年癡呆的第二大常見誘因[1]。目前全球癡呆病人約3 600萬人，預計2030年將達到6 600萬人，2050年將達到1.1億人左右[2]，這給社會和家庭帶來沉重的經濟和社會負擔，因此，尋找有效的治療VD藥物迫在眉睫[3-4]。由于中藥具有多途徑、多靶點、多層次作用特點和優勢，因此，在防治VD方面發揮重要作用。恒清Ⅰ號方是本課題組治療VD經驗方，本研究觀察恒清Ⅰ號方對VD大鼠Morris水迷宮的作用，探討恒清Ⅰ號方對VD大鼠空間學習、記憶能力的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用3月齡體重250～300 g清潔級健康雄性SD大鼠36只，購自上海靈暢生物科技有限公司[合格證編號：SCXK(滬)2018-0003]，飼養環境：溫度22～24 ℃，自由進食、飲水，適應性飼養1周。

1.2 實驗藥物 奧拉西坦膠囊(商品名為歐來寧，國藥準字：H20031033，批號：059190102，石藥集團歐意藥業有限公司生產，每粒0.4 g)。中藥恒清Ⅰ號方的藥物組方：益智仁30 g，菟絲子15 g，川芎15 g，石菖蒲20 g，熟地黃15 g，杜仲15 g，地龍10 g，郁金15 g，天麻10 g，鉤藤10 g。中藥材均由上海市第六人民醫院提供，符合2015年版《中國藥典》要求。按處方比例稱取藥材，加10倍量水浸泡0.5 h，煎煮3次，每次40 min，過濾，合并3次濾液，37 ℃水浴加熱濃縮，根據臨床實際用藥情況，對藥液進行濃縮處理，并以中質量濃度匹配臨床實際用藥濃度。中質量濃度濃縮至0.535 g/mL，置于4 ℃冰箱貯存備用。

1.3 實驗儀器 Morris水迷宮型號：JLBehv-MWMG-1，上海吉量軟件科技有限公司生產。Morris水迷宮主要用于測試實驗動物(大鼠、小鼠)空間位置覺和方向覺的學習及記憶能力[5]，包含一個黑色池內壁的泳池、圖像采集系統和軟件分析系統。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 適應性飼養1周后將36只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、奧拉西坦組和恒清Ⅰ號方組，各9只。

1.4.2 模型制備 參照文獻[6]以雙側頸總動脈結扎術制備VD模型。所有大鼠術前12 h禁食、4 h禁水，先稱重，以2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射充分麻醉后，采用仰臥位固定大鼠，頸前區去毛，碘伏消毒，頸正中切口處縱向切開皮膚和皮下組織，頸部肌肉進行鈍性分離，使雙側頸總動脈鞘游離，分離頸總動脈、迷走神經等，充分顯露雙側頸總動脈。模型組、奧拉西坦組及恒清Ⅰ號方組大鼠均以4-0號縫線雙重結扎頸總動脈，再以0號縫線對皮膚進行縫合，最后碘伏進行消毒。假手術組大鼠均按上述方式麻醉、消毒，在頸正中行縱形切口，雙側頸總動脈鈍性分離后，即縫合手術切口；同時白熾燈照射大鼠，使其肛溫維持在37 ℃左右，蘇醒后，放回鼠籠繼續飼養。

1.4.3 藥物干預 造模7 d后，奧拉西坦組給予奧拉西坦溶液(奧拉西坦膠囊加入生理鹽水中配制而成)灌胃，每日2次。恒清Ⅰ號方組給予恒清Ⅰ號方灌胃，每日2次；奧拉西坦溶液或恒清Ⅰ號方給藥濃度，根據人和動物體表面積折算系數換算[7]，計算結果為14.8 g/kg。假手術組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每日2次。

1.4.4 Morris水迷宮測試大鼠空間學習記憶能力 干預4周、8周后，分別進行Morris水迷宮實驗，測試大鼠空間學習和記憶能力。Morris水迷宮行為學測試包括定位航行實驗和空間探索實驗。

1.4.4.1 定位航行實驗(測試大鼠空間學習能力) 隨機選擇一個象限的池壁中點作為入水點，將大鼠面向池壁輕輕放入水中，Morris水迷宮軟件程序記錄大鼠從入水到成功爬上水下平臺所需的時間，即逃避潛伏期(escape latency，EL)。若經過120 s后大鼠未找到平臺，則人為引大鼠至平臺休息30 s；否則EL為120 s。測試結束后，不管大鼠是否爬上平臺，均應保持大鼠在平臺上停留學習30 s，且相鄰象限時間間隔不少于15 min。每只大鼠均測試4次，取平均值作為最終測試結果。

1.4.4.2 空間探索實驗(測試大鼠空間記憶能力) 定位航行實驗完成次日，移走平臺，選取與之前平臺所在象限相對的象限中點作為大鼠入水點，讓大鼠進行120 s自由游泳，記錄120 s內大鼠為尋找平臺而在平臺象限游泳時間占總時間百分比，即原平臺所在象限停留時間與總時間比值(percentages of time spent in the target quadrant，PTSTQ)。

2 結 果

2.1 恒清Ⅰ號方對VD大鼠空間學習能力的影響 干預4周后，與假手術組比較，模型組、奧拉西坦組和恒清Ⅰ號方組大鼠EL均延長，差異均有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，奧拉西坦組和恒清Ⅰ號方組大鼠EL均縮短，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，恒清Ⅰ號方組EL與奧拉西坦組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。干預8周后，與假手術組比較，模型組、奧拉西坦組和恒清Ⅰ號方組大鼠EL均延長，差異均有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，奧拉西坦組和恒清Ⅰ號方組大鼠EL均縮短，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；與奧拉西坦組比較，恒清Ⅰ號方組大鼠EL縮短，差異有統計學意義(P<0.05)。奧拉西坦組干預8周與干預4周比較，EL無明顯變化(P>0.05)；恒清Ⅰ號方組干預8周EL較干預4周明顯縮短(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠EL比較(±s) 單位：s

2.2 恒清Ⅰ號方對VD大鼠空間記憶能力的影響 干預4周后，與假手術組比較，模型組、奧拉西坦組和恒清Ⅰ號方組大鼠PTSTQ均減少，差異均有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，奧拉西坦組和恒清Ⅰ號方組PTSTQ均增加，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；恒清Ⅰ號方組PTSTQ與奧拉西坦組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。干預8周后，與假手術組比較，模型組、奧拉西坦組和恒清Ⅰ號方組PTSTQ均減少，差異均有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，奧拉西坦組和恒清Ⅰ號方組PTSTQ均增加，差異均有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；與奧拉西坦組比較，恒清Ⅰ號方組PTSTQ增加，差異有統計學意義(P<0.05)。奧拉西坦組干預8周PTSTQ與干預4周比較，差異無統計學意義(P>0.05)；恒清Ⅰ號方組干預8周PTSTQ高于干預4周(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠PTSTQ比較(±s) 單位：%

3 討 論

VD屬中醫學“愚癡”“癡呆”“善忘”等范疇。中醫學認為該病病位在腦，病機為本虛標實、虛實夾雜。本虛為腎精虧虛，標實為風、火、痰、瘀互結內阻。

恒清Ⅰ號方是本課題組治療VD經驗效方，其以益智仁為君藥，以川芎、石菖蒲、熟地黃、杜仲、地龍、郁金為臣藥，以天麻、鉤藤為佐使藥，共同發揮補益腎精、化痰祛濁、活血化瘀作用，從而充養髓海，恢復神智。前期臨床研究已證實，恒清Ⅰ號方可顯著改善VD病人認知功能，療效明顯優于單純西藥尼莫地平治療，且安全性良好[8]，且恒清Ⅰ號方與多奈哌齊聯用可提高VD病人長谷川癡呆量表、簡易精神狀態量表與日常生活能力量表評分，療效顯著。其藥物作用機制可能是改善VD病人血液流變學指標，減輕炎癥反應，降低氧化損傷，改善微循環，修復神經元細胞，保護中樞神經元，從而改善VD病人日常生活能力及認知功能。

現代藥理研究已證實，益智仁水提物通過抑制SD大鼠乙酰膽堿酯酶活性，增加海馬蛋白含量，改善東莨菪堿所致大鼠記憶獲得障礙[9]；菟絲子多糖可降低應激狀態下小鼠大腦皮質中脂質過氧化物丙二醛含量及增加超氧化物歧化酶活性，通過抗脂質過氧化保護腦組織[10]。川芎主要有效成分川芎嗪通過激活核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶-1(Nrf2/HO-1)通路以減輕缺血導致的大腦炎癥，下調神經元一氧化氮合酶以保護腦部神經[11]；石菖蒲水煎液能改善阿爾茨海默病小鼠空間學習記憶能力[12]；熟地黃可改善D-半乳糖衰老模型大鼠學習記憶能力，提高腦組織抗氧化能力，減緩其腦細胞衰老[13]。杜仲皮通過激活c-Jun氨基末端激酶、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸激酶(Akt)、糖原合酶激酶-3(GSK-3β)和核因子κB(NF-κB)通路減弱氧化應激，保護神經元細胞免受細胞凋亡[14]。地龍可促進神經細胞再生，修復損傷后神經功能，其水提取液能改善局灶性腦缺血再灌注損傷大腦皮層損傷[15]。郁金水煎劑可明顯降低全血黏度，減少血小板聚集，郁金醇提物可明顯降低血漿纖維蛋白含量，減少血栓形成[16]。天麻有效成分巴利森苷能減輕小鼠空間學習記憶能力損傷[17]；鉤藤有效成分異鉤藤堿可保護腦細胞、減緩癡呆，其機制是通過清除過氧化脂質體及代謝產物、抗氧化、抑制谷氨酸損傷[18]。

本研究結果表明，與模型組比較，藥物干預組(恒清Ⅰ號方組和奧拉西坦組)干預4周、干預8周大鼠EL均縮短，PTSTQ均增加，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；奧拉西坦組干預8周與干預4周比較，EL和PTSTQ無明顯變化，差異均無統計學意義(P>0.05)。與干預4周比較，恒清Ⅰ號方組干預8周EL縮短，PTSTQ增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。與奧拉西坦組干預8周比較，恒清Ⅰ號方干預8周EL均縮短，PTSTQ均增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。

綜上所述，恒清Ⅰ號方可明顯改善血管性癡呆大鼠學習記憶能力，且干預8周效應優于干預4周效應，且優于奧拉西坦干預8周效應。