五味子乙素對心肌缺血再灌注心肌細胞及線粒體損傷的影響

武衛黨，張丹鳳，郭紀文，徐曉輝，路 艷，陳文璐，耿蓬勃

心肌缺血/再灌注造成的損傷是目前臨床限制冠狀動脈介入治療、冠狀動脈搭橋和冠狀動脈溶栓等治療手段有效開展的關鍵問題，且可能導致心肌缺血/再灌注性二次損傷，嚴重限制上述手術治療手段的廣泛運用，給病人健康帶來了極大風險[1]。五味子乙素是在中藥北五味子中含量最高的聯苯環辛烯類木脂素。北五味子屬于收斂固澀藥，具有益氣生津、寧心安神功效，使其廣泛存在于補益類的方劑之中，同時具有辛、甘、酸、苦、咸五種藥性，酸、咸入肝而補腎，辛、苦入心而補肺，甘入中宮益脾胃，常用于治療肝臟疾病。有研究發現，北五味子乙素對大鼠心肌缺血再灌注損傷有一定的保護作用，其機制可能與減少氧自由基釋放、保護缺血心肌免受缺血再灌注損傷有關，北五味子乙素對大鼠離體心肌缺血再灌注損傷具有保護作用，通過誘導自噬改善缺血再灌注損傷發生[2-4]。內質網是細胞蛋白合成的主要場所，在缺氧、氧化應激等情況下，內質網未折疊的蛋白質明顯增多，當超過內質網處理能力，細胞激活相關信號級聯反應，恢復內質網蛋白質折疊環境，但持續的內質網應激發生可誘導下游分子激活，直接誘導細胞凋亡發生，也導致線粒體氧化應激反應，影響線粒體功能。線粒體是細胞能量發生器，線粒體功能異常進一步促進細胞凋亡的發生[5-6]。本研究將通過建立大鼠心肌細胞缺氧/復氧模型及內質網激動劑誘發的大鼠心肌細胞內質網應激模型，探討五味子乙素對心肌細胞缺血再灌注及內質網應激導致線粒體損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及主要儀器 五味子乙素、毒胡蘿卜素內脂購自Sigma公司。H9c2大鼠心肌細胞株購自中國科學院上海細胞庫；改良Eagle培養基(DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自GIBCO公司；ATP檢測試劑盒、線粒體提取試劑盒均購自江蘇碧云天生物技術研究所；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)、丙二醛(MDA)，線粒體呼吸鏈復合酶試劑盒(南京建成生物工程公司)；細胞色素C、Caspase 3、Caspase 9酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(Santa，美國)。主要儀器Heracell 240i型二氧化碳培養箱(Thermofisher公司，美國)；BCM-1000生物潔凈工作臺(青島聚創美家環保技術有限公司)；酶標儀(Tecan公司，瑞士)。

1.2 H9c2大鼠心肌細胞株培養 H9c2大鼠心肌細胞株培養在含10%新生牛血清的DMEM培養基中，于37 ℃、5%的CO2細胞培養箱中孵育。取對數生長期細胞，D-hanks液漂洗后加入含1%新生牛血清的DMEM培養基。不做缺氧/復氧處理，即為正常組。

1.3 H9c2缺氧/復氧模型及毒胡蘿卜素內脂誘導內質網應激模型建立

1.3.1 缺氧/復氧模型 將H9c2心肌細胞置于37 ℃、95%N2、5%CO2恒溫培養箱中培養，10%FBS的DMEM培養液更換為磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液，在缺氧復氧培養箱充入95%N210 min后，將缺氧復氧培養箱放入37 ℃的恒溫培養箱中進行缺氧4 h，之后去掉PBS緩沖液，重新加入10%FBS的DMEM培養基，放置于37 ℃，20%O2，5%CO2中培養12 h后檢測各項指標即為模型組。五味子乙素干預組分別于缺氧4 h模型建立后，給予五味子乙素低劑量、中劑量、高劑量(5 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L)干預12 h檢測各項指標。

1.3.2 毒胡蘿卜素內脂誘導內質網應激模型 將H9c2心肌細胞置于37 ℃，5%CO2恒溫培養箱中培養后，10%FBS的DMEM培養液培養，加入40 nmol/L毒胡蘿卜素內脂24 h，檢測各項指標。五味子乙素干預組分別于毒胡蘿卜素內脂加入后，給予五味子乙素低劑量、中劑量、高劑量(5 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L)干預24 h檢測各項指標。

1.4 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色(MTT)法檢測H9c2細胞存活率 將H9c2心肌細胞以1×104個/孔接種于96孔板中，細胞貼壁后，缺氧細胞4 h后分別加入不同濃度五味子乙素(分別為20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)，每孔200 μL，每個濃度設5個復孔，培養12 h后，用于MTT檢測；H9c2心肌細胞以1×104個/孔接種于96孔板中，分別加入不同濃度五味子乙素(分別為20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)及30 nmol/L毒胡蘿卜素內脂24 h后，用于MTT檢測。檢測細胞每孔中加入5 g/L的MTT 20 μL繼續培養4 h，棄去上清液，向每孔中加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL溶解結晶體，置于搖床振蕩10 min，至藍紫色顆粒完全溶解后，于酶標儀570 nm波長處測定每孔吸光度值(A)，實驗重復3次。

1.5 心肌細胞SOD、GSH-Px活性、MDA含量檢測 采用南京建成生物醫學工程研究所購買的SOD、GSH-Px、MDA試劑盒，檢測兩種模型心肌細胞SOD、GSH-Px活性、MDA含量。

1.6 分離提取線粒體、細胞質 按照試劑盒方法，用細胞刮收集5×107個細胞，預冷PBS沖洗，4 ℃條件下，600 r/min離心5 min；棄上清液，加入1 mL線粒體提取液，并加入蛋白酶抑制劑，置于冰上孵育10 min；轉移細胞懸液至預冷的Dounce勻漿器中，研磨。4 ℃條件下離心10 min；取上清液，4 ℃條件下，17 000 r/min離心20 min；收集上清液的細胞質部分，將沉淀保存于線粒體儲存液中；BCA蛋白定量，樣品于-20 ℃保存。

1.7 觀察指標

1.7.1 檢測心肌細胞ATP含量 將處于對數生長期的H9c2心肌細胞接種于12孔板中，每孔5×105個細胞，1 mL培養液，培養12 h，待細胞覆蓋板底70%后建模加藥處理。設置藥物濃度為20μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L，另設對照組。收集細胞于離心管中，10 000 r/min離心5 min，棄上清液，每管加入100 μL裂解液。待細胞充分裂解后，4 ℃條件下，12 000 r/min離心10 min，取上清液用于后續測定。取新96孔板，每孔加入100 μL ATP工作液(1∶100)，室溫下放置5 min。待底物ATP消耗完畢，避光條件下每孔加入30 μL BCA法蛋白定量后樣品，2 s后立即檢測。以上實驗步驟重復3次。

1.7.2 線粒體復合物Ⅲ、Ⅳ活性檢測 采用紫外分光光度法測定線粒體復合物活性，操作步驟按線粒體復合物定量檢測試劑盒產品說明書進行。

1.7.3 心臟細胞谷氨酸脫氫酶、細胞色素C、Caspase 3、Caspase 9檢測 按照谷氨酸脫氫酶、細胞色素C、Caspase 3、Caspase 9檢測試劑盒方法進行，所有檢測指標均進行標準曲線建立，樣品吸光度值(A)根據標準曲線計算濃度。

2 結 果

2.1 五味子乙素對H9c2模型細胞活力的影響 細胞活力實驗結果表明，缺氧復氧模型心肌細胞相對于正常細胞，其細胞活力顯著降低，五味子乙素可明顯增加心肌細胞活力，具有明顯的濃度依賴性。內質網模型細胞活力顯著降低，給予五味子乙素可顯著升高細胞活力并具有濃度依賴性。詳見圖1。

與模型組比較，*P<0.05。

2.2 五味子乙素對心肌細胞SOD、GSH-Px、MDA水平的影響 與正常組比較，缺氧/復氧模型及毒胡蘿卜內脂誘導大鼠心肌細胞抗氧化酶SOD、GSH-Px活性均降低，MDA顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。五味子乙素具有顯著抑制氧化應激反應作用，顯著升高SOD、GSH-Px活性，并降低MDA含量，在缺氧/復氧模型五味子乙素均具有該作用。詳見表1。

表1 五味子乙素對心肌細胞SOD、GSH-Px、MDA水平的影響(±s)

2.3 五味子乙素對線粒體復合物Ⅲ、Ⅳ活性的影響 與正常組比較，缺氧/復氧及內質網應激細胞兩種模型心肌細胞線粒體復合物Ⅲ、Ⅳ活性較正常細胞均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。給予五味子乙素后可明顯提高線粒體復合物Ⅲ、Ⅳ活性，其中五味子乙素中劑量組、高劑量組與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 五味子乙素對線粒體復合物Ⅲ、Ⅳ活性的影響(±s) 單位：mmol/(min·mg)

2.4 五味子乙素對心肌細胞中ATP含量的影響 兩種模型細胞線粒體能量供應降低，ATP含量降低。通過檢測細胞ATP含量顯示，兩種模型心肌組織ATP含量均顯著降低(P<0.01)，給予五味子乙素后兩種模型細胞ATP含量顯著提高(P<0.05)。詳見表3。

表3 五味子乙素對不同模型細胞ATP含量的影響(±s) 單位：μmol/mg

2.5 五味子乙素對細胞色素C、Caspase 3、Caspase 9水平的影響 兩種模型組相較于正常組，細胞色素C、Caspase 3、Caspase 9均顯著升高，說明線粒體損傷發生導致細胞色素C釋放，同時激活Caspase 3、Caspase 9；給予五味子乙素后，隨著給藥劑量增加，五味子乙素可有效降低模型心肌細胞中細胞色素C、Caspase 3、Caspase 9水平，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表4。

表4 五味子乙素對細胞色素C、Caspase 3、Caspase 9水平的影響(±s)

3 討 論

心肌缺血后再灌注損傷指冠狀動脈部分或完全急性阻塞后，一定時間內又重新獲得再通，缺血心肌雖然恢復正常灌注，但其組織損傷反而呈進行性加重的病理過程。缺血期引起心肌超微結構、能量代謝、心功能和電生理等一系列變化，血管再通后表現突出，甚至發生嚴重心律失常導致猝死[6]。缺血再灌注損傷發生機制尚未完全明確，自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、中性粒細胞、血管內皮細胞、細胞黏附分子與細胞凋亡等均可能參與缺血再灌注損傷。

目前研究發現內質網應激是導致心肌缺血再灌注損傷的主要誘因之一[7]。內質網是細胞加工蛋白質和貯存Ca2+的主要場所，對維持細胞存活和發揮細胞的正常生理功能具有重要作用。內質網對應激敏感，細胞內外環境應激因子如缺氧、缺糖、ATP耗竭、鈣超載及蛋白降解減弱等刺激下，均引起內質網穩態失衡，使未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網積聚，統稱為內質網應激。內質網應激是機體重要的自我保護機制，但應激反應過強或應激反應時間過長，引起細胞凋亡并導致組織損傷，缺血再灌注損傷時，大量自由基生成引起氧化應激反應等，誘導內質網過度應激，導致心肌組織損傷[8-10]。內質網應激導致應激活化蛋白激酶(JNK)激活，而JNK途徑是調控線粒體功能的關鍵信號途徑，其激活引起線粒體外膜通透性轉變孔開放，導致線粒體膜電位降低，線粒體應激反應和線粒體膜通透性增加[11]，引起線粒體內細胞色素C、Caspase 3、Caspase 9等細胞因子釋放，誘導細胞凋亡發生[12-13]，導致線粒體呼吸鏈正常活動抑制，呼吸鏈復合物活性改變，線粒體ATP產生明顯減少，影響線粒體能量生成[14-15]，最終誘導細胞凋亡發生[16]。

本研究建立缺氧/復氧H9c2心肌損傷模型及毒蘿卜素內脂誘導的H9c2內質心肌細胞內質網應激損傷細胞模型，通過檢測兩種模型五味子乙素對細胞氧化應激反應的干預作用，結果表明五味子乙素可有效改善兩種模型細胞氧化應激狀態，升高SOD、GSH-Px抗氧化酶活性，降低細胞MDA含量，改善脂質過氧化狀態；通過檢測心肌組織谷氨酸脫氫酶和細胞色素C、Caspase 3、Caspase 9，結果發現五味子乙素可同時減少心肌細胞谷氨酸脫氫酶和細胞色素C及Caspase 3、Caspase 9水平，對線粒體膜完整性具有明顯的保護作用。通過檢測心肌細胞ATP水平及呼吸鏈復合酶，結果表明五味子乙素線粒體能量供應具有明顯恢復作用，可有效提高兩種模型細胞ATP含量，恢復部分線粒體復合酶活性。

綜上所述，五味子乙素對心臟缺血再灌注損傷和線粒體功能具有明顯的保護作用。