JSRV-env慢病毒過表達載體構建及其對NIH3T3細胞增殖的影響

楊 惠 劉淑英

(內蒙古農業大學 獸醫學院/基礎獸醫學重點實驗室/農業農村部動物臨床診療技術重點實驗室，呼和浩特 010018)

綿羊肺腺瘤(Ovine pulmonary adenocarcinoma，OPA)是由綿羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV)引起的綿羊可傳播性肺臟腫瘤[1]，目前在全球范圍內廣泛流行并嚴重制約了綿羊產業的發展[2]。OPA 作為一種混合型腺癌，與人肺腺癌之間的組織學相似性使 OPA 成為進一步了解人肺腺癌的有效模型[3]。JSRV 的致瘤作用主要取決于活躍的癌基因——囊膜基因(env)[4]。

為了解JSRV致病機理，大量試驗通過構建動物模型，如羔羊JSRV-env感染模型、小鼠JSRV-env腫瘤模型等，探討JSRV-env引起病理組織結構改變、信號通路激活等問題[2]。但從分子病理學角度出發，為進一步研究JSRV-env致病分子機制，大量試驗構建JSRV-env體外轉染細胞系，通過JSRV-env過表達質粒轉染體外細胞，探討JSRV-env引起細胞轉化的分子致病基礎[3]。由于在自然感染狀態下JSRV僅引起綿羊細支氣管上皮細胞及Ⅱ型肺泡上皮細胞發生轉化，因此需要在體外細胞試驗中構建大量JSRV-env體外轉染細胞系，尋找不同細胞類型中JSRV-env誘導的分子變化共性，區分JSRV-env在不同類型細胞中介導的分子變化差異，最終確定JSRV-env致病的關鍵靶向因子[4-6]。體外細胞試驗證實，JSRV-env能夠誘導多種類型的細胞發生增殖[5-8]。Alla等[5]研究綿羊支氣管上皮細胞時發現JSRV-env作用于受體Hayl2，進一步激活RON信號通路引發細胞增殖能力上調。Varela等[6]研究JSRV-env作用于人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)，同樣發現JSRV-env依賴Hayl2受體介導細胞增殖。也有與之不同的研究報道，Johnson等[7]研究發現，JSRVenv在犬腎細胞(Madin-darby canine kidney)中不依賴 Hayl2 受體激活 PI3K-Akt-mTOR 以及 H/N-Ras-MEK-MAPK 信號通路介導細胞轉化及細胞增殖；Thomas 等[8]研究雞胚成纖維細胞 (DF-1) 也發現 JSRV-env不依賴 Hayl2 受體誘導細胞增殖。由此得出結論 JSRV-env誘導細胞增殖，不同細胞類型所依賴的的受體及信號通路不同[2,5-8]。以上 JSRV-env研究結果為探討致癌基因在細胞轉化及癌癥中的相關作用提供了研究基礎。

由于NIH3T3細胞不具備Hayl2受體，JSRVenv無法依賴Hayl2受體誘導細胞增殖[2]。然而Maeda等[9]研究表明，NIH3T3細胞中轉染JSRV-env真核表達質粒能夠激活Akt/mTOR和MAPK信號通路調控細胞周期。本課題組孫曉林等[10]的研究表明，真核表達質粒pcDNA/myc-His/JSRV-env轉染NIH3T3細胞，JSRV-env過表達能夠激活Akt/mTOR和MAPK信號通路介導細胞自噬。綜上可知，JSRV-env能夠激活Akt/mTOR和MAPK信號通路調控細胞周期及細胞自噬，然而目前尚沒有通過構建JSRV-env慢病毒大量過表達JSRV-env，直接探討JSRV-env對NIH3T3細胞增殖影響的相關研究。因此，本試驗擬以NIH3T3細胞作為研究對象，感染JSRV-env慢病毒過表達JSRV-env，通過噻唑藍(MTT)評價細胞增殖能力，以期為進一步研究JSRV致癌基因env的生物學作用及探討JSRV-env致癌機制提供基礎研究資料。

1 材料與方法

1.1 重組慢病毒載體構建

根據JSRV-env序列(JQ837489.1)，使用Primer 6.0設計引物(表1)，采用高保真DNA聚合酶(生工生物工程，上海)，以pEGFP-C1-JSRV-env標準質粒(農業部動物臨床診療技術重點實驗室保存)為擴增模板，對JSRV-env全長基因序列進行PCR擴增。基因片段純化試劑盒(Takara，大連)回收，ClaI(NEB，美國)酶切紅色熒光報告載體pCMV-dR8.91(生工生物工程有限公司，上海)，通過無縫克隆試劑盒(生工生物工程，上海)將JSRV-env全長基因序列與ClaI酶切后的pCMV-dR8.91載體進行連接。連接體系為：目的片段1 μL；載體3 μL；T4 DNA Ligase 1 μL；Buffer 2 μL；ddH2O 14 μL。22 ℃連接5 h，轉化DH5α感受態細胞。JSRV-envPCR鑒定陽性的轉化子，通過BamHI(NEB，美國)單酶切驗證重組質粒基因片段大小。基因片段大小與預期結果一致的陽性轉化子進一步送至上海生工進行測序。對于測序正確的轉化子，使用質粒小抽試劑盒(Promega，美國)提取質粒并利用分光光度儀(Bio-Rad，美國)測定質粒濃度。

表1 RT-PCR目的基因引物信息Table 1 Primers of target gene for RT-PCR

1.2 JSRV-env重組慢病毒包裝

選擇本實驗室保存的 293T 細胞復蘇，37 ℃,5% CO2條件下培養，待細胞在培養瓶內長至70%～80%進行傳代，待細胞狀態佳，存活率 90% 以上，細胞邊緣清晰時，利用 500 μL 的OPTI-MEM 混勻10 μg重組載體(pCMV-dR8.91-JSRV-env，試驗組)或空載體(pCMV-dR8.91，對照組)，混合 10 μg 包裝輔助質粒pCMV-VSV-G(生工生物工程，上海)對293T進行轉染，6 h后移去培養基上清，更換為DMEM完全培養基。72 h后利用熒光電子顯微鏡觀察293T細胞內是否有紅色熒光蛋白表達，確定重組質粒載入細胞，收集培養基上清，4 ℃，500 g離心10 min，收集上層病毒懸液，利用0.22 μmol/L PVDF過濾器過濾并收集至10 mL離心管。

1.3 JSRV-env重組慢病毒濃縮及滴度測定

將20%的蔗糖溶液加至病毒懸液底部，4 ℃，25 000 g 離心2 h，棄掉上清，室溫晾干至離心管底可見沉淀。用無血清的OPTI-MEM 4 ℃溶解2 h，碎干冰速凍后儲存于-80 ℃。取24孔板接種293T細胞。待細胞融合率為40%～60%，確定感染前實際細胞數目，記為N。病毒10倍稀釋3個梯度(1×10-7g/mL、1×10-6g/mL、1×10-5g/mL)感染293T細胞72 h，利用Image pro plus 6.0統計每視野下熒光表達面積及對應視野下平鋪細胞面積，二者之比為293T細胞內熒光蛋白表達比率。利用DNA抽提試劑盒(Invitrogen，美國)提取 293T 細胞基因組 DNA，利用 Real-time PCR 試劑盒(Takara，大連)擴增 JSRVenv，擴增引物見表2，ABI PRISM 7000 定量系統(Applied biology，美國)定量。循環條件： 50 ℃ 2 min， 95 ℃ 10 min， 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min，40個循環，每組處理重復3次。Real-time PCR 檢測結果采用2-ΔΔCT方法進行計算，測得 293T 細胞每基因組載入的慢病毒拷貝數，進一步計算病毒滴度。病毒滴度(Integration units per mL，IU/mL)的計算公式如下：IU/mL=(C×N×D×1 000)/V(C=平均每基因組整合的病毒拷貝數；N=感染時細胞的數目；D=病毒載體的稀釋倍數；V=加入的稀釋病毒的體積數)。

表2 RT-qPCR目的基因引物信息Table 2 Primer information of the target gene for RT-qPCR

1.4 JSRV-env重組慢病毒感染 NIH3T3

將本實驗室保存的NIH3T3從液氮罐中取出，37 ℃水浴復蘇，待細胞傳至三代穩定后，細胞狀態較佳，細胞邊緣清晰，設置4個細胞試驗組分別加入JSRV-env重組慢病毒(5、10、15和20 μg)感染72 h，每組處理重復3次，確定NIH3T3的最佳病毒感染復數(MOI)。MOI計算公式如下：P=1-P(0)，m=-InP(0)(P=被感染細胞的百分率；P(0)=未被感染細胞的百分率；m=MOI值)。

1.5 噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖能力

培養狀態良好的NIH3T3細胞，設置3個細胞試驗組分別加入完全培養基(空白組)、完全培養基吹打混勻的空病毒載體(對照組)、完全培養基吹打混勻的JSRV-env重組慢病毒(JSRVenv組)，最佳MOI條件下感染72 h。每組取200 μL吹打混勻的細胞懸液進行細胞計數，每組設3個復孔，以3 000個細胞/孔接種于96孔板內，每100 μL加入10 μL MTT檢測液，連續繪制3天細胞生長曲線，酶標儀以570 nm波長檢測OD值。

1.6 統計分析

每組試驗重復3次，試驗數據以均數±標準差(X±S) 表示。所有數據均采用 Graphpad Prism 8.0 軟件處理；兩組均數間比較用t檢驗(t-test)；兩組以上均數的比較采用方差分析(ANVOA)。P<0.05 時認為具有統計學意義，P<0.05為差異顯著，在統計圖中表示為*；P<0.01為差異極顯著，在統計圖中表示為 **。

2 結果與分析

2.1 重組慢病毒載體構建

由圖1(a)可知，擴增出的env目的片段大小與預期序列1 848 bp一致。酶切鑒定完全正確，其酶切產物大小預期7 861 bp(圖1(b))一致。基因片段純化試劑盒分別純化env全長基因序列及ClaI 酶切載體，env同源重組入表達載體，BamHI對重組質粒單酶切，酶切鑒定完全正確，其酶切產物大小預期9 709 bp(圖1(c))一致。最終命名重組質粒為pCMV-dR8.91-JSRV-env，基因結構如圖1(d)。將pCMV-dR8.91-JSRV-env轉入感受態細胞擴增，隨機挑取4個轉化子進行JSRV-env菌落PCR鑒定，擴增產物瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果完全正確，其鑒定產物大小預期1 848 bp(圖1(e))。陽性克隆送至上海生工測序，測序結果與預期pCMV-dR8.91-JSRV-env基因序列一致，提示慢病毒載體構建成功。

(a) 1，從PEGFP-C1-JSRV-env 標準質粒中擴增出目的片段 env; M， DL2 000 marker； (b) 1， pCMV-dR8.91 載體 ClaI 酶切產物； M， DL10，000 marker； (c) 1， pCMV-dR8.91-JSRV-env載體 BamHI 酶切產物； M，DL10 000 marker； (d) pCMV-dR8.91-JSRV-env結構示意圖; (e) 1-4， 隨機挑取的 4 個轉化子； M， DL10 000 marker.(a) 1, The target fragment env was amplified from the PEGFP-C1-JSRV-env standard plasmid; M, DL2 000 marker; (b) 1, ClaI digestion product of pCMV-dR8.91 vector; M, DL10 000 marker； (c) 1, BamHI digestion product of pCMV-dR8.91-JSRV-env vector； M, DL10 000 marker; (d) pCMV-dR8.91-JSRV-env structure diagram; (e) 1-4, randomly selected 4 transformants; M, DL10 000 marker.圖1 pCMV-dR8.91-JSRV-env重組載體構建Fig.1 pCMV -dR8.91-JSRV-env recombinant vector linkage

2.2 JSRV-env重組慢病毒包裝

將上述測序結果正確的轉化子進行質粒抽提并測定濃度。5 μg 的pCMV-dR8.91-JSRV-env和10 μg 包裝輔助質粒pCMV-VSV-G轉染HEK 293T細胞轉染72 h后，在熒光顯微鏡下可觀察到在293T細胞中大量紅色熒光蛋白表達，提示JSRV-env重組慢病毒包裝成功(圖2)。

圖2 pCMV-dR8.91-JSRV env質粒在293T細胞中表達Fig.2 pCMV-dR8.91-JSRV env plasmid expressed in 293T cells

2.3 純化的重組慢病毒滴度測定

利用超速離心沉淀法對重組慢病毒濃縮純化，純化后的病毒進行梯度稀釋并感染 293T 細胞 72 h 后，觀察熒光表達情況。由圖3(a)可見，熒光細胞數隨稀釋倍數增加而相應減少，1及10 μg 的pCMV-dR8.91-JSRV-env感染 293T 細胞72 h，其熒光蛋白的表達占比均>80%(圖3(b))； Real-time PCR 驗證1 μg的pCMV-dR8.91-JSRV-env重組病毒感染293T細胞72 h后，JSRV-env過表達極顯著(P<0.01)(圖3(c))；將 293T 細胞每基因組整合的 JSRV-env病毒拷貝數、感染時的細胞總數、病毒載體稀釋倍數以及稀釋病毒的體積數分別代入病毒滴度計算公式，最終計算得到JSRV-env慢病毒平均滴度為2.99×108IU/mL(表3)。以上結果表明，JSRV-env慢病毒構建成功，并且純化后得到的JSRV-env慢病毒平均滴度為2.99×108IU/mL。

2.4 JSRV-env重組慢病毒感染 NIH3T3 細胞

針對細胞狀態良好的NIH3T3細胞分別加入JSRV-env重組慢病毒(5、10、15和20 μg)感染72 h，每組處理重復3次，熒光場下觀察10 μg JSRV-env重組慢病毒的轉染效率最高(圖4)，根據MOI計算公式，計算得出NIH3T3的最佳病毒感染復數為30 MOI。以上結果表明，JSRV-env慢病毒感染NIH3T3細胞，感染效率最高的病毒感染復數為30 MOI。

2.5 噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖能力

為研究JSRV-env重組慢病毒能否引起NIH3T3細胞增殖發生變化，采用MTT法檢測空白(未感染細胞)組，以及30 MOI感染條件下JSRV-env過表達(感染JSRV-env重組慢病毒)組和對照(感染慢病毒空載體)組的細胞增殖能力。比較各組細胞第12、24、48和72 h的光吸收值，結果表明感染重組慢病毒的NIH3T3細胞中各時間點光吸收值均高于空白組和對照組，其中在48和 72 h 光吸收值差異顯著(P<0.05)(圖5)。以上結果表明，過表達JSRV-env可以上調NIH3T3細胞的增殖能力。

3 討論與結論

3.1 JSRV-env過表達載體

本研究針對JSRV致癌基因env構建過表達慢病毒并進行體外NIH3T3細胞感染，為進一步了解env致瘤機制提供新的研究方法。在前人的研究中，由于JSRV-env真核質粒載體構建流程簡單、試驗周期短，而成為過表達JSRV-env的主要工具[5-8]。但質粒轉染存在許多缺陷：首先，JSRV-env質粒在細胞內轉染效率不穩定，不同細胞在不同轉染方法和不用轉染介質中，轉染效率差別大，且大部分細胞轉染效率不高；其次，JSRV-env質粒轉染進入細胞核效率低，特別是陽離子脂質體對細胞損傷較大[11]。與質粒相比，病毒載體轉染效率高，可實現體外細胞的高效且穩定轉導[12]。目前常用的兩種JSRV-env真核質粒共2種：一種為帶HA標簽的pcDNA3.1真核質粒[13]；另一種為帶HIS標簽的pcDNA4.0質粒[9]。其中，pcDNA3.1質粒需要插入SPA提高JSRV-env表達效率[13]，與JSRV-env質粒轉染細胞相比，JSRV-env慢病毒載體感染細胞一方面可以過表達env；另一方面慢病毒的長末端重復序列(Long terminal repeats，LTRs)含有病毒啟動子和增強子元件能夠增強病毒的表達，極大地還原了病毒對細胞的作用條件，是目前 JSRV-env過表達較為理想的載體[14]。

(a)倒置顯微鏡白光場和熒光場下，不同病毒量的 pCMV-dR8.91-JSRV-env重組慢病毒感染 293T 細胞 72 h 后的熒光蛋白表達情況；(b)不同病毒感染量的 JSRV-env 慢病毒感染 293T 細胞 72 h 相對熒光蛋白表達率分析結果；(c) pCMV-dR8.91-JSRV-env 感染 293T 細胞 72 h，Real-time PCR 檢測 293T 細胞中 JSRV-env 相對表達量分析.(a) Fluorescent protein expression of 293T cells infected with pCMV-dR8.91-JSRV-env with different viral amounts under white light field and fluorescent field of an inverted microscope for 72 h. (b) Relative fluorescence analysis results of protein expression rate; (c) pCMV-dR8.91-JSRV-env infected 293T cells for 72 h, Real-time PCR analysis of the relative expression of JSRV-env in 293T cells.**表示極顯著性差異(P<0.01)** indicate extremly significant differences (P<0.01)圖3 JSRV-env重組慢病毒滴度測定Fig.3 Titer determination of JSRV-env recombinant lentivirus

表3 JSRV-env重組慢病毒滴度Table 3 Virus titers of JSRV-env

圖4 不同載量 JSRV-env 重組慢病毒感染 NIH3T3 細胞Fig.4 NIH3T3 cells infected with JSRV-env at different loads

*表示顯著性差異(P<0.05)* indicates significant difference (P<0.05)圖5 MTT法檢測JSRV-env慢病毒感染 NIH3T3 細胞增殖Fig.5 Detection of proliferation of NIH3T3 cells infected with JSRV-env lentivirus by MTT assay

3.2 JSRV-env 體外誘導細胞增殖機理

在本研究中JSRV-env重組慢病毒以最佳感染條件轉染NIH3T3細胞72 h，噻唑藍(MTT)檢測顯示，JSRVenv過表達可顯著促進NIH3T3細胞增殖。Maeda等[9]利用pcDNA 3.1-JSRV-env真核質粒轉染大鼠腎上皮細胞RK3E的研究與本研究結查基本一致。在JSRV-env過表達的大鼠腎上皮細胞RK3E細胞中，JSRV-env激活MEK-1(PD98059)和H/N-Ras(FTI-277)位點，Ras-Raf-MEK-MAPK途徑被激活，從而介導細胞增殖[2]。此外也有報道指出添加MEK-1抑制劑PD98059于JSRV-env過表達的大鼠腎上皮細胞RK3E細胞中，可以抑制細胞轉化但不影響細胞增殖，添加 H/N-Ras 抑制劑FTI-277可以影響細胞增殖但差異并不顯著[15]。相反Ras-Raf-MEK-MAPK途徑在犬腎MDCK細胞轉化中不表現介導細胞增殖的生物學功能[2,7]。因此，闡明物種差異、細胞類型和試驗條件對了解JSRV-env影響細胞增殖的機制具有重要意義[2,7,10]。基于以上研究結論，推測本試驗中過表達JSRV-env的NIH3T3細中，JSRV-env不依賴Hayl2受體激活Ras-Raf-MEK-MAPK信號通路，通過介導細胞周期縮短最終造成NIH3T3細胞大量增殖[2,9-10]，深入機理尚需進一步研究。本研究可為今后深入探討JSRV-env誘導NIH3T3細胞信號通路激活、下游致病分子基礎等，提供高效、穩定的JSRV-env體外轉染模型。

3.3 結論與展望

本研究通過構建pCMV-dR8.91-JSRV-env慢病毒過表達載體，轉染HEK 293T細胞成功獲得JSRVenv重組慢病毒，并將JSRV-env重組慢病毒感染NIH3T3細胞，表明JSRV-env重組病毒顯著促進對NIH3T3細胞增殖，為進一步揭示JSRV-env生物學作用及探討JSRV致癌機制提供基礎。未來可以將JSRV-env慢病毒載入不同類型細胞，通過構建多種JSRV-env體外過表達細胞模型，進一步探討JSRV-env作用靶點及相關信號通路，更加完善JSRV-env致癌機制。