夏季層疊式蛋雞舍乳頭式飲水工藝細菌含量檢測

萬 意 盛環宇 馬瑞鈺 杜 強 楊榮斌 詹 凱*

(1.安徽省農業科學院 畜牧獸醫研究所/畜禽產品安全工程安徽省重點實驗室，合肥 230001；2.安徽農業大學 動物科技學院，合肥 230001；3.安徽圣迪樂村生態食品有限公司，安徽 銅陵 244100)

隨著蛋雞產業的迅速發展，雞舍內部的環境衛生質量逐漸受到養殖企業的重視[1-2]。持續不斷的清潔飲用水和干燥的采食環境對雞群胃腸道系統健康和日常生產性能至關重要[3-5]。乳頭式密閉式飲水系統是目前國內規模化蛋雞場普遍采用的飲水裝置，可以有效地封閉水源，提高水質潔凈度[6-7]。在生產過程中，大部分養殖場為了防止水線乳頭故障漏水和雞群飲水外灑滴落糞便傳送帶，導致傳送帶上糞便含水率增加，通常在飲水線水管的下方對應安裝一條V型接水槽，將灑漏出的水盛接起來匯集流向舍外[8-9]。由于V型槽長期暴露于空氣環境中，生物氣溶膠中致病菌落[10]及水線水中夾雜的金屬沉淀物和各種藥物等會滴落至槽中聚集[11]，在適宜溫度下造成微生物迅速繁殖，時間久了還會形成一些粘稠的沉淀污物附著于槽壁上。通過對籠內雞群活動的觀察發現，蛋雞在采食后喜歡啄飲V型槽中的水和堆積物，這可能會對雞群的生長健康和生產性能有著嚴重影響。

本研究擬以8層層疊式密閉籠養蛋雞舍為研究對象，在夏季高溫天氣對舍內不同籠層飲水裝置中細菌微生物進行檢測，比較水線水和V型槽水的污染情況及其對蛋雞產蛋性能和蛋品質的影響，以期為蛋雞舍內環境控制和乳頭式飲水系統的完善提供指導依據。

1 材料與方法

1.1 試驗雞舍概況

本試驗于2019年06-04—08-13，在安徽圣迪樂村生態食品有限公司的8層層疊式籠養密閉雞舍內進行。雞舍分為上下各4層，中間為鋼網管理走道，單棟存欄羅曼粉殼商品蛋雞5 萬只；雞舍呈南北走向，長73.0 m，寬16.0 m，高6.3 m，4列5走道，單列單層籠位數量為135個；舍內安裝縱向濕簾通風系統，濕簾位于雞舍凈道端山墻及兩側，面積138 m2；風機位于污道端山墻上，分3層排列，每層6臺；采用行車喂料、乳頭飲水器飲水、傳送帶清糞、自動集蛋系統的生產工藝。試驗雞日糧營養水平參照《羅曼粉殼商品蛋雞飼養管理手冊》執行。

1.2 試驗動物與分組

在蛋雞371日齡時，選擇雞舍內東邊相鄰2列的前端(靠近濕簾端，第13號籠)、中端(第73號籠)、后端(靠近風機端，第133號)，每端選測1、3、5、7層，共計24個監測點(圖1(a)(b))，試驗期內若有雞只死亡，則選用體重相近的雞只代替。

1.3 水線水和V型槽水采集

每2周1次，測定各監測點對應雞籠內水線內水和V型槽內水(圖1(c))細菌總拷貝數，同時記錄各點的溫度和濕度。水線水用無菌離心管直接接取50 mL；V型槽中積水用2 mL膠頭滴管吸取，V型槽內無水時使用滅菌棉拭子刮取，一同加入離心管后加DEPC水稀釋至50 mL。所有采樣材料均提前1天高壓滅菌。

1.4 細菌總數測定

1.4.1引物設計

Real-Time PCR(QPCR)引物使用諾禾致源16S rDNA微生物測序引物擴增16S V4～V5區域，引物序列為515-F：5′-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3′；907-R：5′-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3′，擴增片段長度為412 bp。

圖1 采樣檢測點示意圖Fig.1 Diagram of the monitor points

1.4.2樣本總DNA提取

離心管中50 mL樣本過濾于0.22 μm 濾膜后，用1 mL滅菌水洗脫；拭子用滅菌水渦旋洗滌，使得細菌充分溶解于1 mL水中；樣本DNA采用磁珠法DNA提取試劑盒提取(MagBead DNA Purification Kit，CW2508)，使用微量核酸檢測儀器測定濃度(杭州奧盛Nano-100，超微量核酸蛋白定量儀)，用于檢測后數據計算。

1.4.3標準品質粒制備

標準品以大腸桿菌16S rDNA為參照物，根據細菌16S rDNA通用引物(515-F/907-R)擴增位置，將大腸桿菌16S rDNA第515～926位共412 bp的序列插入克隆載體pUC57中(本試驗標準品質粒采用基因合成的形式獲得)，重組標準品質粒命名為pUC57-16S rDNA。pUC57-16S rDNA全長3122 bp，抽提質粒濃度為142.93 ng/μL，計算其拷貝數為4.17×1010拷貝數/μL。用ddH2O將標準品稀釋至拷貝數為4.17×109～4.17×103拷貝數/μL，共計7個濃度梯度，用于標準曲線建立。

1.4.4QPCR反應體系及步驟

采用SYBR Green I法實時熒光定量PCR(絕對定量)進行樣本細菌總拷貝數檢測；定量PCR試劑盒為TransStart Green qPCR SuperMix(北京全式金，AQ131)。20 μLQPCR反應體系如下：2×PCR Mix10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，RNaseFree ddH2O 7 μL，模板2 μL。反應條件：94 ℃預變性30 s；循環程序為94 ℃變性5 s，61 ℃退火延伸50 s，共40個循環。熔解曲線法的反應條件如下：97 ℃ 1 s，65 ℃ 60 s，95 ℃ 1 s；其中 65～95 ℃區間為熔解曲線生成區間。

1.5 產蛋性能測定

在各監測點選擇3個相鄰籠位為1組，每籠飼養6只雞，每組共18只雞。試驗過程中，每天上午記錄各組蛋雞的產蛋率、雞蛋質量和畸形蛋率。每2周1次，收集各組蛋雞所產雞蛋，測定蛋品質性狀：雞蛋質量、蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋殼顏色、蛋黃顏色、蛋白高度和哈氏單位。蛋殼顏色用蛋殼顏色測定儀(QCR 型)測定，使用前采用黑白2塊標準瓷塊校正，黑色瓷塊的校正值為0，白色瓷塊的校正值為79.9，分別測定蛋殼鈍端、中間和銳端3個點的蛋殼顏色，最后取平均值；蛋殼厚度用蛋殼厚度測定儀(GSA-1020型)測定；蛋殼強度用蛋殼強度測定儀(EGG-0503型)測定；雞蛋質量、蛋白高度、蛋黃顏色和哈氏單位用多功能蛋品質分析儀(EMT-5200型)測定。

1.6 數據處理

試驗數據采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，使用Turkey法進行多重比較，試驗結果以“平均數±標準差”表示，以P<0.01作為差異顯著性判斷。每1 mL樣本水中細菌總拷貝數以10為底取對數表示。

2 結果與分析

2.1 不同籠層的溫、濕度

夏季不同時間測定第1、3、5、7層溫度和濕度見表1。不同時間點所測定溫、濕度存在明顯差異，由平均值來看，舍內平均溫度從第1層(29.33 ℃)至第7層(30.26 ℃)逐漸升高，平均相對濕度呈降低趨勢。

表1 夏季雞舍內不同籠層溫度和濕度Table 1 The temperature and humidity on different tiers in layer house during summer

2.2 不同籠層水線水和V型槽水中細菌總拷貝數

夏季不同時間測定第1、3、5、7層水線水和V型槽水中細菌總數見表2。各籠層水線水中細菌總拷貝數在各階段差異不大，第5、7層平均值比第1、3層約高0.16個單位(1.45倍)。各籠層V型槽水細菌總拷貝數各階段差異不大(P>0.01)，其中第1層平均值最高為9.77個單位，第7層值最低為9.70個單位。比較水線水和V型槽水細菌總拷貝數，發現各階段V型槽水中細菌總拷貝數均遠高于水線水中(P<0.01)，高達46.77至 1 905.46 倍。

2.3 不同籠層蛋雞生產性能和蛋品質

舍內不同籠層蛋雞產蛋率、畸形蛋率及蛋品質比較分別見表3、4。各籠層產蛋率存在顯著差異(P<0.01)，第7層最高為81.08%，第1層最低為77.61%，第3層和第7層均高于第1層和第5層。各籠層畸形蛋率無顯著差異(P>0.01)。從蛋品質性狀看，第1層雞蛋質量最大，蛋黃顏色最深，蛋殼強度最小；第7層雞蛋質量最小，蛋殼強度最大；蛋殼顏色最深，蛋黃顏色最淺；第7層蛋白高度和哈氏單位均顯著高于其他各層(P<0.01)；各籠層蛋殼厚度均無顯著差異(P>0.01)。

2.4 細菌拷貝數與產蛋率和蛋品質的相關性分析

水線水和V型槽水細菌數與產蛋性能的相關性分析見表5。水線水和V型槽水中細菌總拷貝數在各籠層均呈弱正相關，相關系數r=0.046～0.183。水線水中細菌總拷貝數與產蛋率均呈弱相關；與雞蛋質量除了在第7層呈弱負相關，在其他層均呈弱正相關；與蛋白高度和哈氏單位在第3、5層呈正相關，在第1、7層呈弱負相關。V型槽水中細菌總拷貝數與產蛋率和雞蛋質量除了在第1層呈弱正相關，在其余各籠層均呈負相關；與蛋白高度和哈氏單位在各籠層均呈不同程度弱負相關(r=-0.037～-0.192)。

表3 雞舍內不同籠層產蛋率和畸形蛋率Table 3 The laying rate and abnormal egg rate of layers ondifferent tiers in layer house

3 討論與結論

雞群采食和飲水是有害微生物進入體內的主要途徑[12]，隨著密閉式乳頭飲水器的普及，水線水的生物安全防治逐漸得到生產者的重視[13]，但是V型接水槽的衛生情況容易被忽視。飲水器漏出的水和雞采食的殘渣滴漏至V型槽中，加上長期暴露于空氣中從而促使細菌滋生嚴重，還可能會產生有害氣體[14]。利用16S rDNA 細菌通用引物擴增，通過實時熒光定量PCR法檢測細菌含量已被廣泛的應用于畜禽健康及其制品的衛生安全[15-17]。本試驗應用實時定量PCR 的方法成功檢測了水線水和V型槽水中細菌含量，發現在夏季各階段所測V型槽水中細菌總拷貝數量在各籠層均遠遠高于水線水中，最高可達1 905倍。水線水中細菌含量遠低于V型槽中，這是因為生產過程中會對雞群飲用水提前進行消毒處理，同時舍內水線水也會定期沖洗，然而從未清洗處理過V型槽內積水和堆積的內容物，因此槽內細菌微生物隨著時間繁殖滋生，污染程度遠高于水線水中。

韓海霞等[18]發現在5層層疊式籠養蛋雞舍內，上層產蛋率高于下層；盧元鵬等[19]通過比較不同4層層疊式雞舍不同籠層蛋雞產蛋性能，發現第1層產蛋率最低，第3層產蛋率最高。本試驗中，8層層疊式蛋雞舍內第3、7層產蛋率高于第1、5層，雞蛋質量小于第1、5層，剔除雞只本身的原因，這可能還與各籠層間溫度、濕度、通風量等環境差異有關[19-20]；第1、5層V型槽中細菌總拷貝數高于第3、7層，因此推測蛋雞產蛋率可能與V型槽內微生物環境有關，槽內污物等有機物中含有大量的病原微生物，如不及時清理和消毒，會使致病菌滋生易引起禽病發生，從而降低生產性能[21]；同樣發現第7層蛋雞蛋白高度和哈氏單位均顯著高于其余各層，這可能與第7層V型槽中細菌總拷貝數最低有關，推測V型槽內環境水平可能對蛋雞輸卵管健康有一定影響。

商品蛋雞場環境衛生監測是蛋雞養殖技術體系的重要部分，養殖場在完善禽病防控的過程中，禽舍內部環境的消毒和病原微生物控制至關重要[22-23]。本試驗中，水線水和V型槽水中細菌總拷貝數在不同籠層均呈正相關，因為當雞啄飲乳頭時會造成飲水器漏水或外灑至V型槽內[8]，所以水線中微生物滋生也會增加V型槽中的細菌數量。水線水中細菌總拷貝數與產蛋率、雞蛋質量、蛋白高度和哈氏單位在各籠層均呈不同程度的正、負弱相關，且無規律性，未呈現出對生產性能和蛋品質有影響趨勢；V型槽水中細菌數與產蛋率和雞蛋質量在第3、5、7層均呈弱負相關，與蛋白高度和哈氏單位在各籠層均呈不同程度弱負相關，表明V型槽內細菌微生物污染有致使蛋雞生產性能和雞蛋品質下降的趨勢，舍內雞群若長期啄飲V型槽內水可能會影響機體健康。因此，雞場在做好舍內飲水線安全衛生控制的同時，還需要提高對V型水槽內污染情況的關注。

層疊式蛋雞舍內V型槽內細菌含量遠高于水線水中，槽內污染嚴重時可能會導致有害菌群滋生，對蛋雞健康、產蛋性能和蛋品質有較大的潛在負面影響。養雞場可以定期采集舍內水樣和V型槽內容物，監測細菌微生物含量和污染情況，進一步按照飲水衛生管理的要求，依照自身條件制訂并執行一套實用的V型槽清潔消毒技術規程。