敦煌醫方瞿麥湯對腎草酸鈣結石大鼠核轉錄因子2-NAD (P) H 醌氧化還原酶 1通路的影響?

李榮科，顏春魯,2△，安方玉,2，劉永琦,2，劉雪松，趙文坤，楊曉蓉

(1. 甘肅中醫藥大學，蘭州 730000； 2. 敦煌醫學與轉化教育部重點實驗室，蘭州 730000)

泌尿系結石是泌尿外科的常見病和多發病，嚴重威脅患者的生活質量[1]。 研究表明，草酸鈣引起的腎結石在泌尿系結石中約占80%左右[2]，其中，自由基堆積引起的氧化應激損傷是導致草酸鈣結石發生的重要原因[3]。大量研究發現，腎結石形成過程中會發生超氧化物歧化酶(SOD)活性明顯下降，丙二醛(MDA)含量明顯升高[4]，說明腎結石形成過程中伴隨著自由基的代謝紊亂。但這種損傷是通過何種信號通路調控的機制仍無法解釋。為此，本研究以乙二醇聯合氯化銨連續灌胃28 d制作大鼠草酸鈣結石模型，并用敦煌醫方瞿麥湯對腎結石大鼠進行干預，觀察敦煌醫方瞿麥湯對腎結石模型鼠Nrf2-NQO1信號通路中Nrf2和NQO1基因表達的影響，初步揭示敦煌醫方瞿麥湯的干預機制，為敦煌醫方瞿麥湯的臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠60只，體質量(180±20)g，購自甘肅中醫藥大學科研實驗中心動物飼養室(合格證號 SCXK(甘)2011-0001)。本實驗已通過甘肅中醫藥大學科研實驗中心實驗動物倫理委員會審查。

1.2 試劑

鈣(Ca2+)試劑盒、磷(P)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為 20171023、20171023、20171105、20171021)；Trizol Reagent 試劑(美國，批號 47123)；GoScript TM Reverse Transcription System 試劑盒和 GoTaq qPCR Master Mix 試劑盒(Promega，批號分別為0000073135和 0000121531)；GAPDH、Nrf2和NQO1引物(均由 TaKaRa 寶生物工程(大連)有限公司設計并合成)，其序列如下：GAPDH上游引物 5′-TGAAG GTCGCTGTCAACGGA-3′，下游引物 5′-GATGGC ATGGA CTGTGGTCAT-3′；核轉錄因子2(Nrf2)：上游引物 5′-TTGGCAGAGACATTCCC ATTTGTA-3'，下游引物 5′-GAGCTATCGAGTGA CTGAGCCTGA-3′′； NAD (P) H 醌氧化還原酶 1(NQO1)上游引物 5′-TGGAAGCTGCAGACCTG GTG-3′，下游引物 5′-CCCTTGTCATACATGGT GGCATAC -3′。

1.3 儀器

FA2004 N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；V1500型可見分光光度計(上海美析儀器有限公司)；ZY12306型微量加樣器(Scien TiFic公司)；TDZ5-WS型醫用離心機(湖南平凡科技有限公司)； Q5000 超微量紫外可見分光光度計(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；S1000TM Thermal Cycler(BIO-RAD)；7500 Real Time PCR System(英濰捷基(上海)貿易有限公司)。

1.4 藥物

瞿麥湯組成：瞿麥15 g，石韋30 g，滑石30 g，石膏30 g等。具體換算方法可以參考文獻[5]，瞿麥湯人常用劑量是105 g/d，換算成標準體質量大鼠的劑量：105×0.018=1.89 g/鼠，按照大鼠的標準體質量為200 g，則大鼠的劑量1.89 g×5≈9.45 g/kg。換算成大鼠中劑量：105×0.018×5≈10 g/kg，敦煌醫方瞿麥湯高、中、低劑量分別為20、10、5 g/kg。腎石通顆粒(修正藥業集團股份有限公司，國藥準字Z22021933，批號Z720382)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

將60只SPF級SD雌性大鼠按隨機數字表法分為空白對照組、模型組、腎石通顆粒組、敦煌醫方瞿麥湯高、中、低劑量組每組各10只。參照文獻[6]，結石組及干預組采用1%乙二醇+2%氯化銨的混合液每日2 mL灌胃，連續28 d；造模同時給予藥物干預，腎石通顆粒組給予腎石通顆粒(2.7 g/kg)灌胃治療，敦煌醫方瞿麥湯組按高、中、低劑量(20、10、5 g/kg)灌胃治療，假手術組和模型組大鼠給予等體積蒸餾水灌胃，每日1次，連續4周。末次給藥24 h后稱量各組動物體質量，股動脈處死動物摘取動物的腎臟備用。

2.2 指標測定

2.2.1 動物體質量及腎指數測定 稱量各組大鼠體質量、腎臟質量并計算腎指數。腎指數(mg/g)=腎質量(mg)/體質量(g)。

2.2.2 血清生化指標測定 末次給藥后，股動脈采血靜置2～3 h，1500 r/min離心10 min，分離血清。比色分析法檢測血清Ca2+、P含量，具體操作按試劑盒說明書進行。

2.2.3 腎組織SOD活性和MDA含量測定 稱取腎臟200 mg，用1.8 mL生理鹽水研磨組織，制備10%的勻漿液，取上清備用。比色分析法檢測腎組織SOD活性和MDA含量，具體操作按試劑盒說明書進行。

2.2.4 腎組織Nrf2和NQO1mRNA表達測定 用RNA抽提試劑提取腎組織RNA，Q5000測定 RNA 含量。按Promega 試劑盒說明書步驟合成 cDNA 第一鏈，按Promega實時熒光定量試劑盒操作說明書進行 PCR 反應。反應條件：預變性 95 ℃、2 min， 變性 95 ℃、15 s，退火 58 ℃、45 s，延伸 60 ℃、 1 min，共 45 個循環。每個樣品各重復 3 次，數據經 2-ΔΔCt處理后進行Nrf2和NQO1基因相對表達量分析。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 對腎草酸鈣結石模型大鼠體質量及腎指數的影響

表1示，與空白對照組比較，模型組大鼠體質量明顯降低，腎指數明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，敦煌醫方瞿麥湯各干預組大鼠體質量明顯升高，腎指數顯著降低(P<0.05)。

表1 敦煌醫方瞿麥湯對腎草酸鈣結石模型大鼠體質量及腎指數的影響

3.2 對腎草酸鈣結石模型大鼠血清Ca2+、P含量和腎組織SOD活性、MDA含量的影響

表2示，與空白對照組比較，模型組大鼠血清Ca2+含量和腎組織MDA含量均顯著升高，SOD活性明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，敦煌醫方瞿麥湯各干預組大鼠血清Ca2+含量和腎組織MDA含量均顯著降低，SOD活性均明顯升高(P<0.05)。

表2 敦煌醫方瞿麥湯對腎草酸鈣結石模型大鼠血清Ca2+、P含量和腎組織SOD活性、MDA含量的影響

3.3 對腎草酸鈣結石模型大鼠腎組織Nrf2和NQO1mRNA表達的影響

表3示，與空白對照組比較，模型組腎組織Nrf2和NQO1mRNA表達明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，敦煌醫方瞿麥湯中、高劑量組大鼠腎組織Nrf2和NQO1mRNA表達明顯升高(P<0.05)。

表3 敦煌醫方瞿麥湯對腎草酸鈣結石模型大鼠腎組織Nrf2和NQO1mRNA表達的影響

4 討論

泌尿系統結石是一種發病機制未明的多因素疾病，其中尿液中高濃度的草酸鹽和鈣離子結合形成的草酸鈣是形成尿石癥的重要原因。乙二醇和氯化銨兩類化學試劑通過不同的作用機制誘發腎結石形成，乙二醇主要通過自身代謝產生的草酸經腎小管排泌作用造成腎小管及腎間質損害，誘發腎結石，氯化銨則是通過酸化尿液促進草酸鈣結晶的析出而誘發腎結石[7]。本實驗采用1%乙二醇+ 2%氯化銨對大鼠進行灌胃造模，經造模28 d 后可致大鼠血清中Ca2 +含量明顯升高。而經敦煌醫方瞿麥湯治療后不同程度地降低血清中 Ca2 +濃度，抑制大鼠腎草酸鈣結石。

當腎形成草酸鈣結石以后，會損傷腎小管上皮細胞，促使體內自由基的產生增加，減弱機體對自由基的清除能力，從而造成組織結構的損傷。超氧化物歧化酶(SOD)是機體內重要的抗氧化酶系，主要通過清除機體的自由基而維持機體氧化和抗氧化之間的動態平衡，丙二醛(MDA)則是機體脂質過氧化的產物。因此， SOD和MDA是檢測機體氧化應激反應的標志性指標[4]。在氧化應激反應的調控信號通路中，Nrf2/ARE信號通路發揮著關鍵作用[8]。Nrf2是一種發揮細胞自我保護作用的重要轉錄因子。Nrf2既是生理條件下細胞自我保護的轉錄因子，還是機體在病理狀態下發揮重要的抗氧化應激和防御外源性有毒物質入侵的感受器[9]。ARE作為機體重要的抗氧化反應元件發揮作用。研究證實，Nrf2與ARE結合通過啟動Ⅱ相代謝酶和抗氧化酶基因表達來保護機體組織細胞的正常功能[10]。在氧化應激狀態下，機體 Nrf2 激活ARE的基因序列，上調其下游相關因子NQO1、HO-1、 γ-GCS等表達，從而發揮自身抗氧化應激的作用[11]。在實驗中，1%乙二醇+ 2% 氯化銨可顯著降低模型組大鼠腎組織SOD活性，Nrf2和NQO1 mRNA的相對表達，升高其MDA的含量，證明造模劑可造成大鼠腎組織抗氧化功能及自主防御功能的破壞。而給予敦煌醫方瞿麥湯干預治療，可提高大鼠腎組織SOD 活性、Nrf2和NQO1 mRNA 的相對表達，降低其MDA含量，從而減少氧化產物的堆積，提高機體抗氧化水平，減輕大鼠腎小管的氧化應激反應，從而改善腎臟的生理功能。

腎結石屬于中醫學“石淋” “砂淋”等范疇[12]，其病機主要為濕熱蘊結、氣滯血瘀等[13]。本研究采用的敦煌醫方瞿麥湯，主要由瞿麥、石韋、滑石、石膏組成。方中瞿麥具有破血通經、清熱利水的功效；石韋具有清肺止咳、涼血止血、利尿通淋之功效；滑石具有清解暑熱、利水通淋的功效；石膏具有清熱瀉火、止血收濕之功效，諸方合用共奏清熱利濕、活血散瘀、通石排淋之功效。上述一系列實驗結果進一步證實，瞿麥湯對治療腎結石有效。

綜上所述，敦煌醫方瞿麥湯可通過降低大鼠血

清Ca2+濃度和上調Nrf2/NQO1通路相關功能蛋白表達，改善腎臟氧化應激損傷，抑制草酸鈣結石的形成，從而發揮腎損傷的保護作用。