注射用曲札茋苷對呼吸系統疾病作用的實驗研究

趙水仙 楊旭娟 楊曉蕓 黃 茜 黃 青 孟 珂 翁雨天 李 霞 劉一丹*

1.大理大學，云南 大理 671000；2.昆藥集團股份有限公司，云南 昆明 650100； 3.云南中醫藥大學，云南 昆明 650500；4.昆明醫科大學，云南 昆明 650500

曲札茋苷是從植物拉薩大黃根莖中提取出來的一種化合物，分子式C20H22O9，屬于羥基二苯乙烯類化合物，具有較強的生物活性，具有抗凝血、清除氧自由基、抑制血小板聚集、較強的抗氧化性、保護腦組織、抑制炎癥反應和神經細胞凋亡從而阻斷對腦組織的損傷作用[1-2]。注射用曲札茋苷為昆藥集團股份有限公司自主研發的創新藥物，主要用于治療急性缺血性腦卒中，然而對注射用曲札茋苷用于其他新適應癥的報道鮮有，例如對呼吸系統性疾病的作用尚無報道。

咳嗽、哮喘是呼吸系統中最常見的兩種疾病，一般情況下，咳嗽是一種重要的防御機制，通過清除咽部、呼吸道分泌異物從而防止感染形成，但是頻繁劇烈的咳嗽可能引起多個系統的并發癥，給患者造成極大痛苦，嚴重影響患者的工作、生活和社會活動，咳嗽的治療在全球的范圍內受到高度重視。哮喘是臨床上的常見多發病，嚴重威脅著公眾健康和生命安全，根據世界衛生組織統計，哮喘患病人群基數大，患病人口數逐年上升，而我國哮喘藥物主要依賴進口藥[3-4]，因此，研發鎮咳、平喘藥物具有十分重要的意義。

筆者通過濃氨水致小鼠咳嗽法、酚紅排泌法、(Lipopolysaccharide，LPS)致小鼠急性肺損傷、豚鼠磷酸組胺和氯化乙酰膽堿引喘法，觀察曲札茋苷有無鎮咳、祛痰、平喘及對急性肺損傷的保護作用實驗研究，揭示曲札茋苷在鎮咳、祛痰、平喘及治療急性肺損傷上的效果，以期為今后曲札茋苷新適應癥的開發提供參考依據，為研究防治或改善呼吸系統疾病的創新藥物提供實驗基礎。

1 實驗材料

1.1 藥物、試劑與儀器

1.1.1 藥物和試劑 注射用曲札茋苷(昆藥集團股份有限公司，批號：20190822-2)；苯酚紅(天津市光復精細化工研究所，批號：121220)；碳酸氫鈉(天津市光復科技發展有限公司，批號：140816)；氨溴索(昆藥集團股份有限公司，171012-1)；脂多糖(LPS)(sigma,批號：L-2880)；鹽酸地塞米松(國藥集團容生制藥有限公司，批號：1904206)；磷酸可待因(青海制藥廠有限公司，國藥準字號：H63020055 )；氨茶堿(昆藥集團股份有限公司，國藥準字號：H53021194)；磷酸組胺(中國食品藥品檢定研究院，批號：150510-201313)；生理鹽水(浙江國鏡藥業有限公司，批號：A170525 A1)；水合氯醛(山東西亞化學工業有限公司，批號：119957)。

1.1.2 儀器 電子分析天平(Mettler Toledo)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司 DHG-9245A)；酶標儀(美國Bio-Tek powerwave)；離心機(effendorf)；超聲霧化器(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司 402AI)。

1.2 實驗動物 SPF級雄性美國癌癥研究所(Institute of Cancer Research,ICR)小鼠，體重23～25g，由昆藥集團動物室提供，生產許可證：SCXK(滇)K2014-0001；使用許可證：SYXK(滇)K2014-0001；發證機關：昆明市科學技術局。豚鼠，雌雄兼備，昆明楚商科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 濃氨水鎮咳實驗[5]ICR小鼠50只，雄鼠，按體重隨機分為5組，每組10只：空白對照組、陽性對照組磷酸可待因(60 mg/kg)、注射用曲札茋苷低、中、高劑量組(5、10、20 mg/kg)；除磷酸可待因僅實驗當日灌胃給藥1次外，其余各組均預先每日腹腔注射1次，連續3d，空白對照組注射等容量的0.9 %氯化鈉溶液，各組給藥容積均為20 mL/(kg·bw)。末次給藥后30 min,將小鼠逐一放入蒸發皿中，用250 mL燒杯反扣于上，同時向蒸發皿中迅速推入25% 濃氨水0.04 mL。以注入濃氨水至第一次張口咳嗽的時間為動物咳嗽的潛伏期，觀察并記錄各鼠的咳嗽潛伏期及90 s內小鼠的咳嗽次數。為消除系統誤差，實驗采用平行操作。

2.2 磷酸組胺和氯化乙酰膽堿致豚鼠哮喘實驗[6]豚鼠，雌雄兼備，于實驗前一天用0.1 %磷酸組胺和1 %氯化乙酰膽堿以1∶1混合，按每只豚鼠噴霧5 mL對其進行篩選，以45秒內出現呼吸困難或抽搐者為合格。哮喘反應分為四級: Ⅰ級-呼吸加速；Ⅱ級-呼吸困難；Ⅲ級-抽搐；Ⅳ級-跌倒，2 min內未出現II-IV級癥狀者不予選用。

次日將合格豚鼠按性別和體重隨機分為5組，每組10只：空白對照組、陽性對照組磷酸可待因(60 mg/kg)、注射用曲札茋苷低、中、高劑量組(1.25、2.5、5 mg/kg)。除磷酸可待因僅實驗當日灌胃給藥1次外，其余各組動物每日按劑量腹腔注射給藥1次，連續3d，空白對照組注射等容量的0.9 %氯化鈉溶液，容積為2 mL/(kg·bw)。末次給藥后30 min，將豚鼠逐一放入玻璃干燥器內，打開超聲霧化器噴霧45 s，記錄開始噴霧至出現II-IV級癥狀的時間為哮喘潛伏期，若6 min內無上述癥狀則計為360 s。為消除系統誤差，實驗采用平行操作。

2.3 酚紅排泌實驗[7]

2.3.1 酚紅標準曲線的制備 精密稱取苯酚紅適量于容量瓶中，加入5 %的 NaHCO3溶液溶解，配制成100 μg/ mL 苯酚紅母液，吸取適量母液，分別稀釋成含苯酚紅0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5 、10 μg /mL 濃度的標準溶液，以5 %的 NaHCO3溶液作空白調零，于 546 nm波長處測定吸光度值，以苯酚紅濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

2.3.2 小鼠氣管酚紅排泌量測定 ICR小鼠50只，雄鼠，按體重隨機分為5組，每組10只：模型組、陽性對照組(氨溴索，15 mg/kg )、注射用曲札茋苷低、中、高劑量組(2.5、5、10 mg/kg)。各組動物每日按劑量尾靜脈注射給藥1次，連續 3 d，末次給藥前 12 h 禁食不禁水，于末次給藥后1 h，各組小鼠均腹腔注射5 % 酚紅溶液20 mL/kg.bw；注射30 min 后，處死動物，剝離氣管組織，剪下小鼠自甲狀軟骨至氣管分支處的一段氣管，放入預先盛有3 mL 的5 % 碳酸氫鈉溶液的試管內，振搖混勻后，置于離心機中離心(2000 r /min) 5min ，取上清液，于546 nm 處測定吸光度值，并按公式計算酚紅排泌量(μg/mL)。為消除系統誤差，實驗采用平行操作。

2.4 LPS致急性肺損傷實驗[8-10]ICR小鼠60只，雄性，按體重隨機分為6組，每組10只：空白組、模型組、陽性對照組地塞米松(10 mg/kg)、注射用曲札茋苷低、中、高劑量組(5、10、20 mg/kg)；于試驗當天造模(LPS：按5 mg/mL，30 μL/只劑量，采用氣管滴入法推入)，空白組給予同等的手術刺激。造模后1 h，按劑量尾靜脈注射給藥1次，連續5d，空白、模型組均給予同體積的0.9 %氯化鈉溶液。

2.4.1 肺指數、肺含水量測定 末次給藥后1 h處死小鼠，開胸取肺，用吸水紙吸干表面的血液和水分，用電子天平稱量全肺濕重(wet weight，W)，以全肺濕重與動物體重的重量百分比為肺指數(lung index，LI)，于恒溫干燥箱80℃干燥24 h后，稱量肺干重(dry weight，D)，以(肺濕重-肺干重) / 濕重比值(W- D) / W為肺含水量。

3 結果

3.1 注射用曲札茋苷對濃氨水致咳嗽模型小鼠鎮咳作用的影響 與模型組比較，注射用曲札茋苷低劑量組和陽性對照磷酸可待因組均能明顯減少小鼠對濃氨水致咳嗽的咳嗽次數(P<0.05)。注射用曲札茋苷中劑量和高劑量組也可減少咳嗽次數，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 注射用曲札茋苷對濃氨水致咳嗽模型小鼠鎮咳作用的影響

3.2 注射用曲札茋苷磷酸組胺和氯化乙酰膽堿致豚鼠哮喘實驗 與模型組比較，曲札茋苷低劑量組能顯著延長豚鼠哮喘潛伏期，差異具有統計學意義(P<0.05)。其余各組均具有延長潛伏期的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

組別給藥途徑動物數/只劑量哮喘潛伏期/s模型組腹腔注射9-81.22±14.71陽性對照組(氨茶堿)灌胃1040 mg/kg139.30±79.77?注射用曲札茋苷低劑量組腹腔注射101.25 mg/kg133.90±72.01?注射用曲札茋苷中劑量組腹腔注射102.5 mg/kg100.3±42.36注射用曲札茋苷高劑量組腹腔注射105 mg/kg93.9±42.29

3.3 注射用曲札茋苷對苯酚紅排泌模型小鼠祛痰作用的影響

3.3.1 苯酚紅標準曲線 以5 %的碳酸氫鈉溶液作為空白對照調零，在可見分光光度計上 546 nm波長測定吸光度值，以吸光度值對溶液中酚紅的濃度作回歸，制作標準曲線Y= 0.1059X+ 0.0504 ，R= 0.999其中Y為吸光度值，X為酚紅溶液的濃度(單位: μg/mL )。結果如圖1所示。

圖1 苯酚紅標準曲線

3.3.2 注射用曲札茋苷對苯酚紅排泌模型小鼠祛痰作用的影響 與模型組比較，陽性對照組(氨溴索)能夠顯著增加小鼠氣管酚紅排泌量(P<0.05)；注射用曲札茋苷低、中劑量組均能顯著增加小鼠氣管酚紅排泌量(P<0.01)。見表3。

組別給藥途徑動物數/只劑量酚紅排泌量/ μg/mL 模型組靜脈注射9-1.516±0.450陽性對照組(氨溴索)靜脈注射1015 mg/kg2.120±0.649?注射用曲札茋苷低劑量組靜脈注射102.5 mg/kg2.167±0.512??注射用曲札茋苷中劑量組靜脈注射95 mg/kg2.081±0.381??注射用曲札茋苷高劑量組靜脈注射1010 mg/kg1.690±0.492

3.4 注射用曲札茋苷對LPS致急性肺損傷模型小鼠肺水腫的保護作用 空白組與模型組比較肺系數差異具有高度統計學意義(P<0.01)，說明LPS致小鼠急性肺損傷模型造模成功，與模型組比較，注射用曲札茋苷低劑量組和陽性對照組均能降低LPS誘導小鼠急性肺損傷后的肺指數(LI)和肺含水量(W- D)/W(P<0.05)。見表4。

組別劑量LI(W- D) / W空白組-0.8188±0.0508??0.7787±0.0048??模型組-1.8259±0.54480.7997±0.0093陽性對照組(地塞米松)10 mg/kg1.2747±0.1821?0.7840±0.0047??注射用曲札茋苷低劑量組5 mg/kg1.3751±0.4302? 0.7913±0.0075?注射用曲札茋苷中劑量組10 mg/kg1.6911±0.45940.7948±0.0070注射用曲札茋苷高劑量組20 mg/kg1.6191±0.27650.7951±0.0078

4 討論

小鼠濃氨水鎮咳、酚紅排泌法是一種用于篩選鎮咳祛痰藥物可靠的實驗方法。對藥物的鎮咳效果進行評價可分為：機械刺激法、化學刺激法和抗原致敏引咳法[11]，本研究采用小鼠濃氨水引咳的化學刺激，觀察刺激后90 s內小鼠的咳嗽次數，有鎮咳作用的藥物會明顯減少咳嗽次數；痰液是由肺泡、支氣管、氣管分泌，是引起咳嗽的一個重要因素，當痰液排泌量增多時可減少呼吸道黏膜的刺激，從而起到止咳作用，通過測定氣管段中酚紅排泌量可以判斷出藥物的祛痰效果，有祛痰作用的藥物能夠促進酚紅排泌量。本研究結果顯示，給于小鼠注射用曲札茋苷后，其明顯減少小鼠90 s內的咳嗽次數，增加酚紅排泌量，提示曲札茋苷可以減少呼吸道黏膜的刺激，達到鎮咳效果。

支氣管哮喘是一種慢性炎癥性疾病，以氣道高反應和可逆性氣道阻塞為主要體重，氣道的慢性非特異性炎癥是哮喘發病的病理學基礎，是導致氣道高反應支氣管痙攣的主要原因[12]。目前臨床上應用最多的非特異性氣道激發實驗為吸入組胺和乙酰膽堿。在體研究顯示，曲札茋苷低劑量組能夠顯著地延長豚鼠哮喘潛伏期，表明注射用曲札茋苷有明顯的平喘作用，而它的平喘機制可能與松弛氣管平滑肌有關。

急性肺損傷(ALI)的發生發展十分復雜,肺損傷的保護作用機制涉及多方面因素。近年來，大量研究表明，急性肺損傷的本質發病機制是肺內失控性炎癥反應、機體抗炎、促炎系統的失衡。抑制和阻斷ALI發生時肺內的炎癥反應，改善肺泡-毛細血管膜的通透性是當前ALI治療的主要著眼點之一。其死亡率高達40%～60%[13]，目前ALI藥物治療方面沒有特效藥物。曲札茋苷是從天然藥物中發現的活性成分，研究發現該成分在體內有抗炎、抗血小板及降低血液粘度作用，并具有明確的肺靶向。本研究結果顯示，給于小鼠注射用曲札茋苷后，低劑量組能降低LPS誘導小鼠急性肺損傷后的肺指數和肺含水量，說明曲札茋苷可能是通過抑制和阻斷ALI發生時肺內的炎癥反應，從而達到對肺損傷的保護作用。

綜上所述，注射用曲札茋苷具有鎮咳、祛痰、平喘及急性肺損傷保護作用，對于治療呼吸系統性疾病具有一定的臨床意義和參考價值。本研究僅從注射用曲札茋苷的藥效學方面探索其鎮咳、祛痰、平喘、急性肺損傷保護的作用，對其機制的探索還有待進一步研究。