基于網(wǎng)絡藥理學探討金蕎麥治療慢性咽炎的作用機制

農達梅 左華江 吳春鳳

1.廣西醫(yī)科大學附屬柳州市人民醫(yī)院，廣西 柳州 545006；2. 廣西科技大學，廣西 柳州 545006

咽炎在現(xiàn)代臨床醫(yī)學中作為一種常見的疾病。從相關病理和臨床癥狀上，可以將咽炎劃分為慢性類與急性類，其中慢性咽炎是咽黏膜和淋巴組織的慢性炎癥疾病[1]，經(jīng)常也屬于人體上呼吸道感染的慢性炎癥的一些表現(xiàn)。慢性咽炎一些主要癥狀表現(xiàn)為咽干、咽疼、咽癢、異物感、燒灼感、微痛、惡心、影響睡眠及影響日常生活等[2]。長期患咽炎的大眾，不加以治療，嚴重影響人的生活質量。

金蕎麥(FagopyrumdibotrysHara)為蓼科蕎麥屬植物金蕎麥的根莖，其根莖為常用中藥材，是一種營養(yǎng)豐富并具有重要價值的藥資源植。金蕎麥別名野蕎麥、苦蕎頭、金鎖開銀等，在我國的四川、江西、江蘇等地都有分布。其性涼，味辛澀，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、排膿祛瘀功效，常用于咽喉腫痛、肺熱咳嗽、乳蛾腫痛、頭風痛、消化不良、肝炎腹脹等病癥[3]。現(xiàn)代藥理學研究證實，金蕎麥有顯著的抗癌、抑制腫瘤細胞肺侵襲和轉移的作用，此外還具有消炎抗菌、抗衰老、抗氧化酶活性解熱抗炎、祛痰鎮(zhèn)咳、抗血小板聚集、抗突變、以抵抗自由基的降血糖、血脂作用以及提高免疫力等藥理作用[4-6]。趙炎軍[7]在研究中認為金蕎麥提取物具有一定的體外抗流感病毒作用。本研究利用網(wǎng)絡學藥理方法，從“藥物-化合物-作用靶點-疾病”復雜網(wǎng)狀結構探究金蕎麥治療慢性咽炎的關鍵作用靶點、分子生物學過程、信號通路等。以金蕎麥治療慢性咽炎的基礎研究提供參考思路。

1 方法

1.1 獲取金蕎麥主要化學成分及作用靶點 利用TCMSP(http://tcmspw.com/)數(shù)據(jù)庫找出金蕎麥所有的化學成分，以口服利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18作為條件篩選主要有效成分，根據(jù)DrugBank數(shù)據(jù)庫獲取主要化學成分的預測靶點，并將化合物靶標蛋白逐一輸入String、UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)檢索以剔除重復、非人源的靶點，逐一轉化為主要活性化合物規(guī)范的靶點蛋白的基因標識符(Gene Symbol)。

1.2 篩選慢性咽炎的相關靶點及潛在作用靶點 Gene Cards數(shù)據(jù)庫克服了上百個數(shù)據(jù)庫自身格式的局限，整理歸納了基因表達、功能、位置、通路、變異、同源基因、疾病和相關參考文獻等各種信息，收集整理了上百個網(wǎng)站的內容，并將它們合理地系統(tǒng)地整合到一起。OMIM數(shù)據(jù)庫涵概關于人類遺傳病和基因座位等相關信息、和文獻的中心級數(shù)據(jù)庫。通過以上兩個數(shù)據(jù)，篩選了有關慢性咽炎的靶點1272個。將上述1.1藥物主要化學成分的預測靶點與疾病相關靶點導入Venney2.1分析平臺，取交集靶點，獲得潛在作用靶點。

1.3 金蕎麥化合物-疾病靶點及靶點互作網(wǎng)絡圖的構建 將篩選過后的主要化學成分與交集的潛在作用靶點輸入到Cytoscape3.7.0軟件，構建“藥物-主要成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡，進行拓撲學分析。同時將篩選得到的共有靶點導入String平臺(http://string-db.org)，將Organism設定為“Homo aspiens”，最小交互分數(shù)取0.4，得到靶點互作的(PPI)網(wǎng)絡模型。由于STRING數(shù)據(jù)庫無法直觀的看出靶蛋白的Degree變化，故將STRING的蛋白互作信息保存為TSV格式并導入Cytoscape3.7.0軟件中采用Analyze network工具進行可視化分析，篩選出關鍵靶點。

1.4 關鍵靶點GO富集分析及相關信號通路注釋分析 為進一步了解上述篩選出的關鍵靶點的功能及相關信號通路的作用，將上述1.3的得到的關鍵靶點導入DAVID6.8數(shù)據(jù)平臺進行GO(Gene Ontology)生物學過程富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes Genomes)信號通路富集分析，設置靶基因名稱為人類進行篩選，將所有靶基因名稱校正為官方名稱(office gene symbol)，通過設定閾值P<0.01，得到生物學過程、分子功能、細分和相關通路分析結果，并利用Origin7.5軟件將其結果可視化。

2 結果

2.1 金蕎麥主要化學成分的篩選、收集 通過TCMSP平臺數(shù)據(jù)庫檢索“金蕎麥”，總化合物為45種，以OB ≥30%，DL≥0.18為篩選條件選出15個潛在治療作用的活性化學成分，見表1。15個活性化合物共有100個作用靶點。

表1 金蕎麥中主要化學物信息

2.2 共有靶點的收取 將金蕎麥潛在活性化合物的作用靶點與Gene Cards數(shù)據(jù)庫及OMIM數(shù)據(jù)庫檢索出的慢性咽炎疾病靶點在Venney2.1平臺做韋恩圖，交集靶點40個，可認這40個靶點是金蕎麥治療慢性咽炎的主要靶點，如圖1。

圖1 金蕎麥活性成分靶點與慢性咽炎靶點Venny圖

2.3 PPI網(wǎng)絡圖構建 將金蕎麥治療慢性咽炎的40個主要靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，得到治療靶點的PPI網(wǎng)絡，通過Cytoscape進行可視化。由圖2可知，線條表示靶點與靶點之間相互作用關系。該網(wǎng)絡由260條邊組成一個完整的蛋白網(wǎng)絡互作圖。該圖中圓形的大小和顏色，從淺色圓形到深色橢圓形，形狀越來越大，顏色逐漸加深，表明Degree度值增大。PPI蛋白互作關系具體見表2(僅列出前20個靶點)。由表2可知，靶點平均Degree為13，Average Shortest Path Length(平均最短路徑長度)在1.3到2.8之間，網(wǎng)絡中節(jié)點的Closeness Centrality(連通度)、Betweenness Centrality(介數(shù)中心性)曲線接近于冪律分布，其中節(jié)點度值越大的節(jié)點，平均最短路徑長度越短的節(jié)點，表明該節(jié)點與慢性咽炎的相關性越大，治療慢性咽炎的可能性最大。超過靶點平均Degree的靶點有14個，可認為這14個靶點為關鍵靶點。

圖2 潛在治療靶點蛋白互作圖

表2 交集靶點及其拓撲學特征(表中僅列出前20個)

2.4 金蕎麥化合物-疾病靶點構建分析 從圖3可知，金蕎麥化合物-疾病靶點網(wǎng)絡共有57個節(jié)點，127條邊，包含了1種藥物、1種疾病、15個化合物、40個靶點，其中藍色棱形為藥物，紅色橢圓形為疾病，黃色長方形為化合物，綠色三角形為靶點。從度值大小上來看，排名前4位為quercetin(槲皮素)、luteolin(木犀草素)、β-sitosterol (β-谷甾醇)、isorhamnetin(異鼠李素)，節(jié)點分別為34、17、8、5，這些化合物成分在治療慢性咽炎發(fā)揮著重要作用。

圖3 金蕎麥化合物-疾病靶點網(wǎng)絡圖

2.5 相關通路信息和注釋分析 為了進一步闡明金蕎麥活性成分的作用機制，將上述2.2預測得到的14關鍵靶蛋白導入DAVID數(shù)據(jù)平臺(https://david.ncifcrf.gov)GO富集分析，得出148條目，其中包括生物學過程109條，分子功能30條，細胞組分9條，KEGG分析得到47條KEGG信號通路。經(jīng)Bonferroni校正P<0.01，符合條件的有生物學過程為46條，分別為凋亡過程的負調控(negative regulation of apoptotic process)、藥物反應(response to drug)、上皮細胞增殖的陽性調節(jié)(positive regulation of epithelial cell proliferation)、細胞對白細胞介素-1的反應(cellular response to interleukin-1)、基因表達陽性調節(jié)(positive regulation of gene expression)等，見圖4。取P<0.01，符合條件的分子功能有15條，為酶綁定(enzyme binding)、蛋白質異二聚化活動(rotein heterodimerization activity)、轉錄激活子活性，RNA聚合酶II核心啟動子近端區(qū)序列特異性結合(transcriptional activator activity, RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific binding)、轉錄因子綁定(transcription factor binding)等，見圖5。取P<0.01，符合條件的細胞組分有核質(nucleoplasm)、細胞質(cytoplasm)、核(nucleus)、膜(membrane)和膜筏(membrane raft)，見圖6。取P<0.01得到31條信號通路，包括蛋白聚糖在癌癥(Proteoglycans in cancer)、通路在癌癥(Pathways in cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)、小分子核糖核酸在癌癥(MicroRNAs in cancer)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)等，見圖7。大量的靶蛋白富集在這些注釋和信號通路上，通過-log(p)值顯現(xiàn)富集相關性大小，p越小，-log(p)值越大，則與疾病相關可能性越大。通過生物學過程、分子功能、細胞組分、相關信號通路來預測慢性咽炎，達到治療的目的。

注：圖中僅根據(jù)P值列出前20個生物學過程圖4 關鍵靶蛋白參與生物學過程

圖5 關鍵靶蛋白參與分子功能

圖6 關鍵靶蛋白參與細胞組分

注：圖中僅根據(jù)P值列出前20個KEGG圖7 信號通路柱狀圖

3 討論

慢性咽炎(Chronic Pharyngitis)是一種咽喉部黏膜、黏膜下組織及淋巴組織產生的慢性炎癥，主要患病人群為青壯年。慢性咽炎治療起來病程較長，且癥狀容易反復發(fā)作[8]。根據(jù)流行病學顯示，我國慢性咽炎一直存在著較高的發(fā)病率，特別是在空氣質量較差的大城市，給眾多患者帶來煩惱和負擔，且較多的醫(yī)療資源用于治療咽炎。而引起咽炎的原因非常多，有慢性感染因素和非感染因素。前者為細菌類感染、菌群紊亂、鼻炎類；后者為職業(yè)性暴露、生活習慣及生活環(huán)境等[9]。慢性咽炎屬于傳統(tǒng)醫(yī)學“喉痹”范疇，在《素問·陰陽別論》[10]中提出咽喉者為陰陽升降之路，喉痹之病機主要是人體出現(xiàn)陰陽失衡。而中藥金蕎麥具有多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用的特點，通過多途徑發(fā)揮直接或間接抗病菌、抗病毒治療慢性咽炎的作用。現(xiàn)市場上金蕎麥片聯(lián)合蓮花清瘟膠囊可起到緩解甲型H1N1流感、咽喉腫痛作用。金蕎麥也可作單味藥單獨使用，具有抗炎、祛痰鎮(zhèn)咳的功效，是治療慢性咽炎的有效藥物，但相關報道較少。

本研究通過篩選得到的15種活性成分，主要是黃酮類、甾體、有機酸等化學成分，其中最有意義的是黃酮類，為主要的藥理活性成分[11]。具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和提高機體免疫力等多種藥理學功效。從抗炎的角度探究，槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、異鼠李素對慢性咽炎的治療作用。劉濤等[12]在研究中表明了槲皮素、木犀草素對小鼠鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰的作用及對家兔的慢性咽炎治療作用。倪灣[13]闡述槲皮素的抗炎活性可通過NF-kB和Akt信號通路調節(jié)炎癥因子影響。研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素具有抗炎、抗病毒、抗氧化等作用，抗炎主要是通過抑制脂多糖(LPS)誘導的TNF-α，IL-1β和IL-6在體外和體內的分泌[14]。β-谷甾醇大多數(shù)存在于植物細胞膜中，其抗炎主要機制是對脂多糖誘導巨噬細胞，提高抗炎因子(IL-10)的活性[15]，β-谷甾醇臨床上常用于降低膽固醇。

金蕎麥治療慢性咽炎主要靶點為EGFR、CASP3、ESR1、MYC、IL6等14個。其中EGFR的變化代表慢性咽炎患者的病變水平，在孫恒[16]的研究中表明了血清EGFR的檢測在鼻咽癌患者臨床診治中的重要意義。CASP3作為半胱氨酸蛋白酶族的重要成員，可以通過細胞凋亡有序級聯(lián)反應[17]。MYC的過度表達是人類癌癥特征重要的一個特征，認為MYC癌基因通過轉錄因子，解除大量特定靶蛋白表達的調控，可以通過預測咽炎轉化為咽炎癌類型癌癥。

經(jīng)過GO分析和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，可以發(fā)現(xiàn)金蕎麥的有效化合物能作用于多個位點。如EGFR、CASP3、IL6、MCL1、RELA、 VEGFA、MDM2、MYC參與凋亡過程的負調控的生物學過程；PGR、EGFR、 CCND1、 HIF1A、ESR1、MDM2參與分子功能中酶綁定；PGR、CASP3、CCND1、HIF1A、MCL1、RELA、ESR1、MDM2、MYC參與細胞組分中核質的相關活動；EGFR、CASP3、CCND1、HIF1A、ERBB2、VEGFA、ESR1、MDM2、MYC靶蛋白涉及在蛋白聚糖在癌癥通路上。

綜上所述，網(wǎng)絡藥理學作為一種中藥研究的方法，研究了金蕎麥治療慢性咽炎的潛在作用機制，從而闡明了金蕎麥治療慢性咽炎有效成分與作用靶點及信號通路，并明確了金蕎麥通過多種活性成分、潛在作用靶點、各種生物學過程及信號通路發(fā)揮治療慢性咽炎的的作用機制，這為金蕎麥在慢性咽炎的治療中提供重要的參考價值。