VEGF和p38MAPK在兔退變性腰椎間盤中的表達及意義

張志強，黃吉軍，楊建東，陳 濤，陳 聰，范新宇

（江蘇省蘇北人民醫院骨科，江蘇 揚州 225000）

椎間盤退行性變（Intervertebral disc degeneration, IDD）是一種慢性、進行性的病理過程和機能紊亂，目前引起腰椎間盤退變的具體機制尚不明確。正常椎間盤組織沒有血管，有研究提示[1-2]，椎間盤的血管化以及椎間盤細胞外基質成分改變是椎間盤退變的發病基礎。因為微血管的侵入可激活或加強基質降解酶，細胞外基質合成和分解代謝的失衡，從而導致椎間盤退變。而在細胞外基質調節中，MAPK信號通道發揮著重要作用[3]。然而，在退變椎間盤中，新生血管與p38MAPK信號通道的關系，目前研究較少。本文旨在通過構建兔椎間盤退變模型，來探討VEGF和p38MAPK在椎間盤退變中的作用。

1 資料與方法

1.1 兔腰椎間盤退變動物模型的建立

取健康4月齡雄性新西蘭大白兔10只，質量2.5～3.0 kg，每只新西蘭大白兔L2/3和L3/4椎間盤作為穿刺干預椎間盤，為模型組。L1/2和L5/6椎間盤作為空白對照組。C形臂下定位椎間隙平面，使用18 G穿刺針破皮，調整角度取與椎間隙平面一致、與上下橫突平面呈30°角方向緩慢進針。透視下確認針頭接近椎間盤纖維環，進行穿刺，穿刺有落空感后即停止，反復穿刺5次破壞纖維環。于術后8周處死動物，取椎間盤標本行病理學檢查。

1.2 HE染色觀察組織退變

挑選滿意切片，HE染色后觀察椎間盤組織中有無血管組織浸潤，軟骨細胞是否增生，纖維板狀結構有無破壞，基質是否增生，以此確定是否有椎間盤的退變。

1.3 免疫組織化學染色和圖像分析

用標準免疫組織化學方法，試劑購自福州邁新公司。分別檢測VEGF，和p-p38MAPK。按照試劑說明進行實驗，用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照。細胞質內出現棕黃色顆粒樣物質為陽性。免疫組化染色中胞漿或胞膜中出現紅色顆粒判斷為陽性細胞。每例標本做三張切片，每張切片隨機選取5個視野應用計算機彩色圖像分析系統進行定量分析，計算平均光密度值（OD值）代表染色的強度。

1.4 統計學處理

采用SPSS 16.0軟件分析實驗數據，實驗數據用均數標準差（±s）描述，采用t檢驗，P值＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

整個實驗期間，實驗的新西蘭大白兔均未出現明顯飲食變化、癱瘓以及大小便失禁等異常情況。

2.1 HE染色檢測結果

對照組：整個椎間盤組織結構清晰，膠原纖維走形有序，髓核與纖維環界限清楚。纖維環完整，髓核內細胞較小，呈圓形和類圓形，數量較多，軟骨終板結構清晰，軟骨細胞較多，增生活躍。實驗組：椎間盤組織退變嚴重，纖維環膠原纖維排列紊亂，出現縫隙，斷裂或缺失，髓核內膠原排列紊亂，基質明顯降解。細胞變大變圓，且細胞群集，周圍形成大量基質。

2.2 免疫組化及檢測結果

VEGF在椎間盤組織中的表達變化：對照組：VEGF表達陽性表達主要集中在纖維環周圍組織中的血管內皮細胞。而在組織中軟骨終板、髓核內幾乎看不到陽性細胞；實驗組：椎間盤中大量出現的血管內皮細胞中呈強陽性表達。

p-p38MAPK在椎間盤組織中的表達變化：對照組中部分組織切片，細胞胞漿和細胞核內見淺棕黃色顆粒，呈弱陽性表達，部分細胞核不僅棕黃色顆粒，呈陰性表達。實驗組中，絕大部分組織切片都可見髓核細胞核及靠近核膜的胞質內可見棕黃色或棕褐色顆粒，呈強陽性表達。

每例標本做三張切片,分別在高倍鏡下測其光密度值，計算平均光密度值（OD值），進行半定量分析。實驗組VEGF的OD值明顯高于對照組，實驗組p-p38MAPK的O D值明顯高于對照組。結果見表1，二者差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 VEGF、p-p38MAPK在對照組和實驗組椎間盤中的表達（OD值）

3 討 論

椎間盤組織的逐漸退變與衰老、過度負荷、遺傳及肥胖等多種因素有關。椎間盤退變的實質是基質成分的降解。但引起其退變的具體機制還不是很明了。血管內皮生長因子 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)在血管生成過程中起著關鍵作用，能促進血管內皮細胞分裂，逐漸形成豐富的毛細血管網[4]。通過我們的實驗發現，隨著椎間盤退變的發生，VEGF明顯高于對照組。說明椎間盤的退變伴隨著血管的入侵。我們認為，由于血管的侵入可能滿足了基質降解酶激活所需要的條件,進而導致基質的降解,繼發椎間盤退變。

p38-MAPK廣泛存在于哺乳動物細胞內，將細胞外刺激信號轉導至細胞核和細胞質中，引起細胞生物學反應，主要參與細胞應激和炎癥反應[3]。我們的研究表明，p38-MAPK的表達明顯在實驗組明顯高于對照組。說明隨著椎間盤退變的發生，伴隨著p38-MAPK通路的激活。

在新生血管周圍，淋巴細胞、巨噬細胞散在或圍繞血管分布，向椎間盤內遷移的內皮細胞是新毛細血管形成的主體細胞[5,6]，椎間盤局部血管增生引發炎癥反應，導致巨噬細胞、神經纖維細胞、內皮細胞等大量細胞及炎性生長因子的級聯反應。而在這些因素的作用下，通過激活p38-MAPK通路調控細胞的增殖、分化及凋亡，影響著椎間盤的退變的發生和發展。

綜上所述，在椎間盤組織中 VEGF和p-p38MAPK的表達和椎間盤組織結構的變化具有相似性，其表達強度與椎間盤的退變密切相關。VEGF和p-p38MAPK可能在緩解或抑制腰椎間盤退變中起到一定作用。