薄荷醇提高臭氧治療大鼠角膜堿燒傷的實驗研究

（.牡丹江醫學院醫藥研究中心，黑龍江 牡丹江 570；.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 5000）

臭氧也稱超氧，是一種超活性氧，氧化性強、水溶性高，常溫下可以解離，具有供氧、殺菌等特點，目前應用于諸多醫學領域，例如皮膚疾病或消毒、周圍血管、腦梗死后遺癥等[1-2]。研究[3-5]發現臭氧還可用于治療眼部疾病，例如病毒性結膜炎和角膜疾病等眼部病變。研究[3]證實臭氧水溶液對兔眼煙曲霉菌性角膜潰瘍具有很好的抗菌治療效果，與氟康唑滴眼之間的比較，療效相似，而且具有天然不耐藥、成本低等優勢。肖彩雯等[4]通過體外滅菌實驗研究，進一步證實了臭氧生理鹽水對真菌性角膜炎的治療效果。

本課題組前期實驗結果顯示，臭氧可以抑制大鼠堿燒傷后的氧化應激反應并改善預后，但由于臭氧水的不穩定性，生物利用度不高，因此如何進一步提高臭氧生物利用度，穩定、加強其療效，對于臨床推廣和使用都具有重要意義，因此，如何提高臭氧的生物利用度，增強治療效果是本次研究需要解決的問題。

薄荷醇屬于萜烯類物質，是唇形科植物薄荷和薄荷精油的主要有效成分。中醫記載，薄荷具有“芳香開竅，引藥上行”滲透促進劑的功能，被廣泛用于中藥外用制劑，與現代經皮促透劑具有相似的作用。由于薄荷醇具有清涼鎮靜的作用，此外還可以使細胞表面的通透性增強，促使藥物進入細胞內，減少藥物表面的滯留時間，因此薄荷醇作為促透劑輔助藥物吸收已成為國內外研究的熱點[6]。薄荷醇除了可以外用，亦可作為清涼劑加入眼部制劑，緩解眼部刺激、干澀、灼熱等癥狀。Ahn等[7]研究顯示，含有薄荷醇的人工淚液明顯緩解干眼癥、促進淚液的分泌，且作用溫和。本研究的主要目的是證實薄荷醇是否可以作為促透劑提高臭氧治療大鼠角膜堿燒傷的治療效果，進而改良臭氧水眼部應用制劑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型制備

SPF級健康雌性大鼠，體重250 ～ 300 g，由牡丹江醫學院醫藥研究中心動物房供給。分為6組（n =6）：對照組（即正常組模型，不做任何處理，僅用于對照）、模型組、臭氧組（2 mg·L-1），0.08%薄荷醇臭氧滴眼液組、0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組、0.12%薄荷醇臭氧滴眼液組。大鼠堿燒傷模型制備：以4 mg·kg-1的劑量使用10%水合氯醛溶液腹腔注射大鼠，進行麻醉。剪切直徑為3.0 mm的圓形濾紙，在1 mol·L-1NaOH 溶液中浸泡60秒，并用其他濾紙將多余液體吸干后，迅速將其附著于角膜表面中央45秒，隨后快速使用生理鹽水于結膜囊沖洗70秒。在角膜中央可以看到灰白色的灼燒區域，呈圓形，大小相同表示建模成功。治療方案：堿燒傷模型組滴眼生理鹽水，每次3滴，每日3次，連續7 d。將臭氧溶解到滅菌注射用水中，制備成3 mg·L-1的濃度用于滴眼治療。 0.08%薄荷醇臭氧滴眼液（甘油0.1 mL，薄荷醇0.003 6 g，臭氧25.2 mL，蒸餾水加至5 mL），0.10%薄荷醇臭氧滴眼液（甘油0.1 mL，薄荷醇0.004 5 g，臭氧25.2 mL，蒸餾水加至5 mL，溶液呈無色透明狀，無刺激性等異味），0.12%薄荷醇臭氧滴眼液（甘油0.1 mL，薄荷醇0.005 3 g，臭氧25.2 mL，蒸餾水加至5 mL），滴注方式同上。治療第7天后，處死大鼠、取材一部分置于EP管中，并儲存于- 80℃冰箱中備用（ELISA法測SOD/MDA），另一部分用于HE染色和透射電鏡標本制作。

1.2 形態學觀察

分別在堿燒傷后第1、3、7天對大鼠眼角膜進行觀察。裂隙燈顯微鏡（SLM2型，重慶康華公司）觀察角膜溶解（使用Pfister評分標準）[8]，角膜渾濁（Holland評分標準）[9]。計算角膜新生血管長度及面積，公式：S = C/12×3.141 6[r2（r - l）2]，C為角膜血管網所占的圓周數，l為新生血管的生長長度，r為角膜半徑。

HE染色：取1 mm×2 mm角膜置10%中性甲醛中固定48 h，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色及照相（Olymspus CKX53，日本Olymspus公司）。

透射電鏡：取1 mm×2 mm角膜置于2.5%電鏡，用戊二醛溶液固定24 h，再經鋨酸固定、脫水、置換、包埋、定位、LKB超薄切片，飽和醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色，透鏡掃描照相（日立HT7800，日本日立公司）。

1.3 統計方法

用SPSS11.0統計軟件對SOD、MDA數據進行處理。數據資料使用均值±標準差的方式表示，采用單因素方差分析的方法，P ＜ 0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 薄荷醇臭氧滴眼液對大鼠角膜堿燒傷后角膜恢復的影響

大鼠角膜堿燒傷后不同時間角膜渾濁Holland評分詳見表1，其中0分最低（模型組），4分最高（對照組），評分越高顯示治療效果越好，實驗評分顯示0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組效果最好。大鼠角膜燒傷后不同時間角膜溶解面積情況詳見表2，角膜燒傷后不同時間角膜血管新生面積情況詳見表3。治療7 d后，與所有模型組相比，0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組角膜溶解面積和角膜新生血管面積最低（P ＜ 0.05）。

2.2 薄荷醇臭氧滴眼液對大鼠角膜堿燒傷后氧化應激損傷的抑制效果

角膜堿燒傷后，模型組與對照組相比MDA含量明顯增加，SOD活力明顯降低（P ＜ 0.05）。經過薄荷醇臭氧滴眼液治療后明顯降低角膜的氧化應激反應。與模型組相比，0.10%薄荷醇臭氧滴眼液劑量組明顯降低角膜組織中MDA的表達（P ＜ 0.05），增加SOD的活性表達（P ＜ 0.05），詳見表4。

表1 各組大鼠角膜堿燒傷后不同時間角膜渾濁Holland評分Tab 1 Holland score of corneal opacity at different time after alkali burn in each group

表2 角膜燒傷后不同時間角膜溶解面積. ±s，mm2Tab 2 Corneal dissolution area at different time after corneal burn. ±s, mm2

表2 角膜燒傷后不同時間角膜溶解面積. ±s，mm2Tab 2 Corneal dissolution area at different time after corneal burn. ±s, mm2

注：與模型組比較，#P ＜ 0.05Note: compared with model group, #P ＜ 0.05

組別 傷后1 d 傷后3 d 傷后7 d對照組 0 0 0模型組 4.56±0.29 4.13±0.20 3.44±0.37臭氧組 4.44±0.32 3.48±0.42 3.15±0.52 0.08%薄荷醇臭氧滴眼液組4.42±0.17 3.12±0.66 2.79±0.31 0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組4.34±0.21 3.01±0.43# 2.45±0.24#0.12%薄荷醇臭氧滴眼液組4.22±0.12 3.11±0.49 2.53±0.25#

表3 角膜燒傷后不同時間角膜血管新生面積.±s，mm2Tab 3 Corneal angiogenesis area at different time after corneal burn. ±s, mm2

表3 角膜燒傷后不同時間角膜血管新生面積.±s，mm2Tab 3 Corneal angiogenesis area at different time after corneal burn. ±s, mm2

注：與模型組比較，#P ＜ 0.05Note: compared with model group, #P ＜ 0.05

組別 傷后1 d 傷后3 d 傷后7 d對照組 0 0 0模型組 3.95±1.58 8.83±2.11 20.17±2.42臭氧組 3.66±0.74 8.59±1.45 18.05±2.32 0.08%薄荷醇臭氧滴眼液組3.49±0.95 8.25±1.31 17.25±2.04 0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組3.36±1.23 8.24±1.54 16.77±3.94#0.12%薄荷醇臭氧滴眼液組3.54±0.90 8.29±1.37 17.49±2.72

2.3 薄荷醇臭氧滴眼液對大鼠角膜堿燒傷后形態學的影響

表4 治療7 d后眼角膜組織中MDA和SOD含量Tab 4 MDA and SOD content in corneal tissue after 7 days of the treatment

HE結果顯示，在角膜燒傷后第7天，對照組大鼠角膜上皮細胞完整，基質膠原纖維排列整齊，未見水腫；模型組角膜上皮細胞與基質層結構疏松，基質膠原纖維排列紊亂，發生水腫；臭氧組角膜上皮細胞完整，基質膠原纖維排列紊亂，水腫程度較輕；0.08%薄荷醇臭氧滴眼液組角膜上皮細胞與基質層結構疏松，基質膠原纖維排列紊亂，發生水腫；0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組角膜上皮細胞結構完整，基質膠原纖維排列趨于整齊，水腫程度較陽性對照組輕；0.12%薄荷醇臭氧滴眼液組角膜上皮細胞與基質層疏松，基質膠原纖維排列紊亂，水腫較模型組輕。

SEM角膜超微結構觀察可見，對照組角膜組織層次分明，上皮細胞間存在半橋粒，線粒體完好，基質膠原纖維細胞排列整齊；模型組急性損傷后角膜上皮組織脫落，細胞腫脹明顯，細胞核大，不規則，基質膠原纖維排列紊亂；0.08%薄荷醇臭氧滴眼液組角膜上皮層次不完整，基質膠原纖維排列紊亂，線粒體變性明顯；0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組角膜上皮細胞層次略完整，細胞略微腫脹，細胞間有半橋粒連接，內質網完好；0.12%薄荷醇臭氧滴眼液組角膜上皮層次不完整，細胞腫脹，基質膠原纖維排列紊亂，線粒體變性明顯。

3 討論

薄荷醇有很強的促滲透作用，是目前臨床領域中應用最為廣泛的一種萜類促透劑[10]。實驗表明[11-12]薄荷醇可促透諸多藥物種類，包括激素類、抗菌類藥物、抗炎類藥物，抗癌、抗腫瘤類藥物、麻醉藥物以及蛇床子素、丹參等中藥[13]。此外，由于薄荷醇自身具有消炎、驅風、鎮痛、止癢的外用功效，在臨床上常用于清涼止癢、頭疼及鼻、咽、喉炎癥以及眼部制劑等。

薄荷醇的促透機制目前尚不明確，很多關于其機制的探討集中在Ca2+的濃度、細胞通透性、清涼、鎮靜等方面[14]。研究[15]證實薄荷醇可能通過TRPM8通道發揮清涼、鎮靜作用，因此可以減輕大鼠角膜堿燒傷后的灼熱效應對細胞造成的損傷。另外，角膜堿燒傷主要的致病原理是熱灼傷和氧化應激反應，新生血管的形成是影響視力恢復的重要環節因素[16]。在本課題組前期的實驗中，已證實臭氧水制劑可以有效改善大鼠角膜堿燒傷后角膜溶解面積、降低新生血管面積、減低渾濁度（原理：臭氧可以釋放游離氧增加細胞氧供，促進細胞恢復；另外，臭氧可以誘導抗氧化應激反應，并且抑制細菌的繁殖[17]），但由于臭氧不穩定，常溫常壓下容易解離[18]，生物利用度差，為了改善提高臭氧進入細胞的有效濃度和速度，采用藥物協同的方式，通過增加薄荷醇作為促透劑，打開細胞膜表面的離子通道，使臭氧盡快進入細胞內，發揮其功效，本實驗結果顯示堿燒傷后7 d，與臭氧組相比，0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組確實可以減輕角膜新生血管面積、降低角膜渾濁度（P ＜ 0.05），并減輕氧化應激反應。薄荷醇作為促透劑有其應用的實驗基礎。

本研究的不足之處：本研究只是初步探索了薄荷醇作為促透劑的可能行，至于是否真正可以應用于產品制劑中，需要進一步的實驗證明。另外，與冰片[19-20]等其它促透劑相比是否有優勢，也還需要進一步去證實。