和厚樸酚通過miR-155靶向抑制Smad3及其抑制高糖誘導腎小球系膜細胞凋亡的機制研究

（.海南省三亞市人民醫院腎內科，海南 三亞 57000；.海南省三亞市人民醫院血液凈化中心，海南 三亞 57000；.廣州中醫藥大學附屬第一醫院藥劑科，廣東 廣州 50400）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見并發癥之一，末期通常會發展至慢性腎功能衰竭[1]。高血糖誘導腎小球系膜細胞（glomerular mesangial cell，GMC）凋亡和缺失，是糖尿病腎病的主要原因[2]。和厚樸酚（honokiol）是從木蘭屬植物中分離的一種小分子多酚，具有抗血管生成、抗炎、抗腫瘤的特性，且沒有明顯的毒性[3]。研究[4]發現，和厚樸酚對炎癥引起小鼠GMC的凋亡具有潛在的抑制作用[5]。研究[6]表明，微小RNA-155（micro RNA-155，miR-155）廣泛參與機體的多種病理生理功能，特別在DN腎組織和高糖誘導的腎實質細胞中表達上調[7]。Smad家族蛋白是一類重要的信號傳導蛋白，在人體多種組織中表達并參與細胞的功能調節，但研究發現其在腎損傷組織中表達異常[8-11]。但是在高糖誘導的GMC中，miR-155和Smad3的關系尚不清楚。因此，本研究以高糖誘導GMC產生的細胞凋亡為模型，探索和厚樸酚對高糖誘導GMC凋亡的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠腎小球系膜細胞系SV40-MES-13（American type culture collection，ATCC細胞庫）；高糖DMEM培養基和胎牛血清（Gibco公司）、胰蛋白酶Trypsin（Gibco公司）；和厚樸酚（Sigma-Aldrich公司）；抗Smad3抗體和抗β-actin抗體（Abcam公司）；總RNA提取試劑盒、real-time PCR試劑盒、反轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）；流式法細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；顯微鏡、Real-time PCR儀（美國Bio-Rad公司）；BCA蛋白濃度檢測試劑盒（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將SV40-MES-13細胞培養于含10%FBS、1%青-鏈霉素的DMEM培養基中，置于37 ℃、5%CO2、濕度95%的培養箱中培養，待細胞融合為一層時，顯微鏡觀察細胞形態，用Trypsin消化傳代。

實驗分組具體如下：空白組：培養基中加入D-葡萄糖5 mmol·L-1；高糖組：培養基中加入D-葡萄糖30 mmol·L-1；高糖+和厚樸酚組：D-葡萄糖30 mmol·L-1+和厚樸酚40 μg·mL-1。

1.2.2 細胞轉染 待SV40-MES-13細胞培養至對數生長期，以每孔約2×105個細胞接種于6孔板中，培養至細胞基本融合為一層時進行轉染。按照Lipofectamine 2000試劑說明書進行操作，將miR-con、miR-155、anti-miR-con、anti-miR-155、WT-Smad3+miR-con、WT-Smad3+miR-155、MUTSmad3+miR-con和MUT-Smad3+miR-155等載體用無血清培養基稀釋，取等體積脂質體和各組載體混合靜置20 min，將混合液加入到培養好的細胞中，培養6 h，換完全培養基，轉染48 h后，收集細胞。

1.2.3 Real-time PCR檢測mRNA的表達 收集對數生長期的各組細胞，提取總RNA，然后反轉錄合成cDNA，反應程序為16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、82 ℃ 5 min；4 ℃放置10 min，合成的cDNA于- 80℃保存。取cDNA按照real-time PCR的說明書進行反應，反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，40個循環；72 ℃ 10 min。miR-155上游引物5’-TTAATGCTAATCGTGATAGG-3’，下游引物為試劑盒內通用引物；Smad3上游引物5’-GAGAGGTGTGCGGCTCTACT-3’，下游引物5’-CTGGTTGCAGTTGGGAGACT-3’；β-actin上游引物5’-CATTGCTGACAGGATGCAGA-3’，下游引物5’-CTGCTGGAAGGTGGACAGTGA-3’。運用Bio-Rad PCR系統進行數據分析，內參參照β-actin。

1.2.4 流式細胞術測定細胞凋亡率 經葡萄糖和/或和厚樸酚處理后，各組細胞以約2×104個/孔接種于6孔板中，置于37 ℃ 5%CO2培養箱中培養72 h，棄培養液，胰酶消化，離心收集細胞，按照Annexin V/PI試劑盒說明書進行操作，重懸細胞，加入5 μL膜聯蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）和5 μL碘化丙啶混勻，室溫避光20 min，流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達 將培養48 h的各組細胞收集后加入RIPA裂解液，超聲破碎，收集蛋白，BCA試劑盒測定總蛋白濃度。進行SDS-PAGE，轉膜，封閉2 h，加入稀釋的一抗（抗Smad3抗體和抗β-actin抗體），4 ℃孵育過夜，洗膜2次，加入稀釋的二抗室溫孵育2 h，以β-actin為內參，分析蛋白表達水平。

1.2.6 雙熒光素酶報告系統實驗 用Trypsin消化轉染48 h后的細胞，將其接種于24孔板中，接種密度1×104個細胞/孔，繼續培養至細胞融合度80% -90%，進行轉染，構建Smad3的野生型（WT-Smad3）和突變型（MUT-Smad3）雙熒光素酶報告載體，然后分別共轉染miR-con或miR-155，48 h后收集細胞，用裂解液室溫裂解20 min，收集上清，加入熒光素酶底物，發光儀檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內參，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.3 統計學處理

數據分析采用SPSS21.0軟件進行，結果以均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，以P ＜ 0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 和厚樸酚對高糖誘導的GMC中miR-155和Smad3表達的影響

qRT-PCR和Western blot結果顯示，與空白組相比，高糖組GMC中miR-155表達量顯著下降（P＜ 0.05），Smad3 mRNA和蛋白表達量顯著上升（P＜ 0.05）；與高糖組相比，高糖組+和厚樸酚組的細胞中，miR-155表達量顯著上升（P ＜ 0.05），Smad3 mRNA和蛋白表達量顯著下降（P ＜ 0.05），見表1。結果表明高糖誘導的GMC中miR-155表達下調，Smad3表達上調，而和厚樸酚逆轉了高糖對GMC中miR-155和Smad3表達的影響。

2.2 過表達miR-155抑制高糖誘導的GMC細胞凋亡

qRT-PCR和流式細胞術結果表明，與高糖+miR-con組相比，高糖+miR-155組的miR-155表達量顯著上升（P ＜ 0.05），細胞凋亡率顯著下降（P ＜ 0.05），見表2。結果表明過表達miR-155可抑制高糖誘導GMC的凋亡作用。

表1 和厚樸酚對高糖誘導GMC中miR-155和Smad3表達的影響. ±s，n = 3Tab 1 Effects of honokiol on the expression levels of miR-155 and Smad3 in mice glomerular mesangial cells induced by high glucose. ±s，n = 3

表1 和厚樸酚對高糖誘導GMC中miR-155和Smad3表達的影響. ±s，n = 3Tab 1 Effects of honokiol on the expression levels of miR-155 and Smad3 in mice glomerular mesangial cells induced by high glucose. ±s，n = 3

注：與空白組相比較，*P ＜ 0.05；與高糖組相比較，#P ＜ 0.05Note：compared with the blank group, *P ＜ 0.05； compared with the high glucose group, #P ＜ 0.05

組別 miR-155 Smad3 mRNA Smad3 蛋白空白組 1.76± 0.35 1.28±0.29 0.56±0.07高糖組 0.48±0.11* 4.86±0.81* 1.27±0.14*高糖+和厚樸酚組 1.94±0.49# 1.46±0.35# 0.62±0.08#F 15.222 42.440 45.155 P 0.005 0.000 0.000

表2 過表達miR-155對高糖誘導腎小球系膜細胞凋亡的影響.±s，n = 3Tab 2 The effect of overexpression of miR-155 on the apoptosis of glomerular mesangial cells induced by high glucose. ±s，n = 3

表2 過表達miR-155對高糖誘導腎小球系膜細胞凋亡的影響.±s，n = 3Tab 2 The effect of overexpression of miR-155 on the apoptosis of glomerular mesangial cells induced by high glucose. ±s，n = 3

注：與高糖+miR-con組比較，*P ＜ 0.0Note：compared with the high glucose + miR-con group, *P ＜ 0.05

組別 miR-155 凋亡率/%高糖組 0.46±0.07 32.27±2.59高糖+miR-con組 0.42±0.08 33.86±2.93高糖+ miR-155組 2.43±0.17* 17.72±1.45*F 295.619 40.936 P 0.000 0.000

2.3 miR-155靶向調控Smad3的表達

Targetscan軟件預測結果顯示，Smad3的3’UTR序列中含有與miR-155互補的核苷酸序列，見圖1。雙熒光素酶報告系統結果如表3所示，與miR-con組相比，miR-155組野生型WT-Smad3的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降（P ＜ 0.05），而突變型MUTSmad3的螢火蟲熒光素酶相對活性沒有明顯變化，說明miR-155與Smad3具有相互作用。Western blot結果表明，與miR-con組相比，miR-155組的Smad3蛋白表達量顯著下降（P ＜ 0.05）；與anti-miR-con組相比，anti-miR-155組的Smad3蛋白表達量顯著上升（P＜ 0.05），見表4，說明miR-155靶向負調控Smad3的表達。

2.4 沉默Smad3抑制高糖誘導的GMC凋亡

qRT-PCR、Western blot和流式細胞術結果顯示，與高糖+si-con組相比，高糖組+si-Smad3組的細胞中Smad3表達量顯著下降（P ＜ 0.05），細胞凋亡率也顯著下降（P ＜ 0.05），見表5。說明沉默Smad3可抑制高糖誘導的GMC凋亡。

圖1 Targetscan對miR-155和Smad3 mRNA核苷酸序列的預測結果Fig 1 Targetscan's prediction of miR-155 and Smad3 mRNA nucleotide sequences

表3 雙熒光素酶報告實驗結果. ±s，n = 3Tab 3 Results of dual luciferase reporter assay. ±s，n = 3

表3 雙熒光素酶報告實驗結果. ±s，n = 3Tab 3 Results of dual luciferase reporter assay. ±s，n = 3

注：與miR-con組比較，*P ＜ 0.05Note： compared with the miR-con group, *P ＜ 0.05

組別 WT- Smad3 MUT- Smad3 miR-con 1.00±0.07 0.95±0.09 miR-155 0.39±0.07* 0.98±0.11 t 10.673 0.366 P 0.000 0.733

表4 miR-155靶向調控Smad3的表達. ±s，n = 3Tab 4 miR-155 targeting regulates the expression of Smad3.±s，n = 3

表4 miR-155靶向調控Smad3的表達. ±s，n = 3Tab 4 miR-155 targeting regulates the expression of Smad3.±s，n = 3

注：與miR-con組比較，*P ＜ 0.05；與anti-miR-con組比較，#P ＜ 0.05 Note：compared with the miR-con group, *P ＜ 0.05； compared with the anti-miR-con group, #P ＜ 0.05

組別 Smad3 miR-con 0.59±0.06 miR-155 0.18±0.05*anti-miR-con 0.54±0.05 anti-miR-155 1.35±0.11#F 140.232 P 0.000

2.5 和厚樸酚通過miR-155靶向抑制Smad3表達，抑制高糖誘導的GMC凋亡

qRT-PCR、Western blot和流式細胞術結果結果顯示，與高糖組相比，高糖+和厚樸酚組的Smad3表達量顯著下降（P ＜ 0.05），細胞凋亡率也顯著下降（P ＜ 0.05）。采用siRNA敲低方法分別敲低miR-155和Smad，發現與高糖+和厚樸酚+anti-miR-con組相比，高糖+和厚樸酚+ anti-miR-155組的Smad3表達量顯著上升（P ＜ 0.05），細胞凋亡率也顯著上升（P＜ 0.05）；與高糖+和厚樸酚+ anti-miR-155+si-con組相比，高糖+和厚樸酚+ anti-miR-155+ si-Smad3組Smad3表達量顯著下降（P ＜ 0.05），細胞凋亡率也顯著下降（P ＜ 0.05），見表6。

表5 沉默Smad3抑制高糖誘導的GMC凋亡. ±s，n = 3Tab 5 Silencing Smad3 inhibited apoptosis of GMC induced by high glucose. ±s，n = 3

表5 沉默Smad3抑制高糖誘導的GMC凋亡. ±s，n = 3Tab 5 Silencing Smad3 inhibited apoptosis of GMC induced by high glucose. ±s，n = 3

注：與高糖+si-con組比較，*P ＜ 0.05Note：compared with the high glucose+si-con group, *P ＜ 0.05

組別 Smad3 mRNA Smad3 蛋白 凋亡率/%高糖組 4.66±0.57 1.16±0.13 31.38±2.74高糖+si-con組 4.54±0.61 1.22±0.14 32.48±2.35高糖+si-Smad3組 0.88±0.12* 0.47±0.07* 14.72±1.61*F 58.403 37.761 57.052 P 0.000 0.000 0.000

表6 和厚樸酚抑制高糖誘導的GMC凋亡. ±s，n = 3Tab 6 Honokiol inhibited apoptosis of GMC induced by high glucose. ±s，n = 3

表6 和厚樸酚抑制高糖誘導的GMC凋亡. ±s，n = 3Tab 6 Honokiol inhibited apoptosis of GMC induced by high glucose. ±s，n = 3

注：與高糖組比較，*P ＜ 0.05；與高糖+和厚樸酚+anti-miR-con組比較，#P ＜ 0.05；與高糖+和厚樸酚+anti-miR-155+si-con組比較，&P ＜ 0.05Note: compared with the high glucose group, *P ＜ 0.05； compared with the high glucose+honokiol+anti-miR-con group, #P ＜ 0.05； compared with the high glucose+honokiol+anti-miR-155+si-con group, &P ＜ 0.05

組別 Smad3 mRNA Smad3 蛋白 凋亡率/%高糖組 4.73±0.62 1.23±0.11 32.02±2.43高糖+和厚樸酚組 1.51±0.41* 0.48±0.06*16.59±2.28*高糖+和厚樸酚+anti-miR-con組1.58±0.44 0.58±0.07 14.72±1.79高糖+和厚樸酚+anti-miR-155組3.95±0.57# 1.09±0.09#28.37±2.17#高糖+和厚樸酚+anti-miR-155+si-con組3.76±0.53 1.04±0.13 29.54±2.94高糖+和厚樸酚+ antimiR-155+ si-Smad3組1.78±0.48& 0.63±0.09&15.20±1.15&F 23.021 33.244 40.127 P 0.000 0.000 0.000

3 討論

隨著人們飲食結構和生活方式的改變，糖尿病發病率越來越高，嚴重危害患者生命健康[12-13]。糖尿病通常引發糖尿病腎病，高血糖會導致GMC脫落和凋亡，最終導致腎小球硬化，腎功能衰竭[14-15]。然而，當前其發病機制未完全闡明、治療效果仍不滿意。

既往研究表明，和厚樸酚能夠通過抑制促炎因子，改善腎纖維化[16]。王葉萍等[17]研究證實，和厚樸酚能有效抑制內毒素誘導的人GMC炎性細胞因子的表達，減輕腎損傷。房云崗等[18]研究表明，和厚樸酚可能通過抑制氧化應激及減輕炎癥反應，抑制由線粒體誘導的凋亡途徑而緩解腎臟缺血再灌注損傷。本研究證實，和厚樸酚可以抑制高糖誘導的GMC凋亡，與之前和厚樸酚保護腎組織細胞的研究結果相似。

miR-155是miRNA家族中典型的多功能miRNA，與細胞增殖、凋亡等密切相關[19]。Beltrami等[20]研究發現，miR-155在糖尿病腎病患者的腎小球和遠端、近端小管中表達異常。本研究結果表明，在高糖誘導的GMC中：miR-155表達下調，加入和厚樸酚后可促進miR-155的表達并減少GMC凋亡；下調miR-155則可逆轉和厚樸酚對GMC凋亡的抑制作用，說明和厚樸酚通過促進高糖誘導的GMC中miR-155的表達抑制GMC凋亡。

Smad3是轉化生長因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）的下游信號分子，參與細胞凋亡、增殖、干細胞分化、胚胎發育等多個生物過程[21]。研究表明，在高糖誘導的足細胞中，Smad3磷酸化水平升高，細胞凋亡水平升高，下調Smad3可抑制高糖誘導的足細胞凋亡[22]。本研究發現，Smad3在高糖誘導的GMC中表達上調；和厚樸酚可抑制Smad3的表達；沉默Smad3可抑制高糖誘導的GMC凋亡，說明和厚樸酚通過抑制Smad3抑制GMC凋亡，與上述結果類似。

Targetscan軟件預測結果發現，Smad3的3’UTR序列中含有與miR-155互補的核苷酸序列，暗示兩者之間可能存在結合位點或調控關系。雙熒光素酶報告系統結果表明，miR-155靶向負調控Smad3的表達，抑制Smad3表達可逆轉miR-155下調對GMC產生的影響。由此說明和厚樸酚通過miR-155靶向抑制Smad3表達，從而抑制高糖誘導的GMC凋亡，證實了在GMC中miR-155與Smad3之間具有調控關系。

本研究證實，在高糖誘導的GMC中，和厚樸酚通過促進miR-155表達，靶向抑制Smad3表達，進而抑制GMC凋亡、減輕高糖誘導的GMC損傷，為和厚樸酚治療糖尿病腎病提供了理論和實驗支持。