電熱損傷法建立新西蘭大白兔宮腔內膜損傷模型*

朱元 ，李歡歡 ，穆松牛 ，王長華

（1.江西省婦幼保健院生殖健康科；2.江西省婦幼保健院麻醉科；3.南昌大學實驗動物科學中心，南昌 330006）

宮腔內膜損傷可表現為宮腔粘連或者子宮內膜薄，是宮腔操作的嚴重并發癥,可以引起不孕、月經過少、閉經或反復流產[1]。近年發病率和檢出率呈上升趨勢，已成為女性繼發不孕的第二大病因[2]。目前，臨床針對宮腔內膜粘連的治療主要是手術恢復宮腔的形態，并配以術后的雌孕激素治療、放置球囊等方法[3,4,5]，但對于子宮生理功能的恢復尚屬于臨床治療的難題，導致宮腔內膜損傷的治愈率和妊娠率無明顯改善，而且中、重度宮腔粘連治療后復發率較高[6]，因此,宮腔內膜損傷的診斷和治療日益受到臨床的重視，亟需建立一個穩定有效的兔宮腔內膜損傷模型，為進一步研究宮腔內膜損傷的發病機制和治療方法奠定基礎。已有的研究中有采用機械損傷法構建宮腔損傷動物模型的，也有采用電熱損傷法構建動物模型的，然建模效果報道不一。本研究旨在通過比較機械損傷和電熱損傷的建模效果，以確定最有效穩定的宮腔內膜損傷建模方法。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇普通級成年雌性新西蘭大白兔75只，12周齡，體質量2.5-3.5kg，常規單籠飼養適應環境1周后，隨機分為3組：電熱損傷組25只，機械損傷組25只，對照組25只。所有動物均購自南昌大學實驗動物科學中心,所有實驗程序均經江西省婦幼保健院動物實驗倫理委員會批準。

1.2 造模方法 按氯胺酮與速眠新1:1配比，0.5ml/kg體重，肌肉注射麻醉。手術區域剃掉兔毛，碘伏消毒后鋪上無菌手術單，下腹部沿腹中線切開約3cm垂直切口，暴露雙側子宮，同時查看排除卵巢、輸卵管及子宮的明顯結構畸形，機械損傷組取雙側子宮，在一側子宮離子宮末端1/3處約1cm的地方剪開一個約相當于子宮周徑1/4的小切口，用直徑4mm子宮內膜刮勺搔刮整個子宮內膜約1min后停止刮宮，縫合子宮切口，同法處理對側子宮，生理鹽水沖洗腹腔后關腹（圖1A，圖1B）。電熱損傷組：在一側子宮離子宮末端1/3處約1cm的地方剪開一個約相當于子宮周徑1/4的小切口，伸進電凝刀，以70W的功率，6mm/s的速度，反復電凝3次以損傷整個內膜（圖1-C），縫合子宮切口，同法處理對側子宮，生理鹽水沖洗腹腔后關腹。對照組只開腹，不損傷子宮（圖1-D）。分別于手術后7d（每組 5 只）、14d（每組 5 只）、28d（每組 5 只）取子宮組織行HE染色及Masson染色。每組剩余的10只新西蘭大白兔用于生育力評估實驗。

1.3 子宮內膜腺體數量及纖維化檢測 兔子宮組織樣本的石蠟切片分別行HE和馬松三色染 色(masons trichrom stain,Masson染色)。每張HE染色切片選取4個高倍鏡視野計數每個視野下腺體數量，取其平均值。每張Masson切片選取4個視野，纖維化面積比率為每個視野子宮內膜間質纖維化的總面積除以子宮內膜間質和腺體面積之和，取平均值，以圖像分析系統自動計算完成。

圖1 手術操作過程圖 1-A,圖 1-B：宮腔搔刮；圖1-C：電刀電凝；圖1-D：兔雙子宮

1.4 生育力評估實驗 手術后7d每組取10只新西蘭大白兔配種，以評估不同的造模方法對母兔懷孕和生育能力的影響。雌兔的發情期受季節、氣候、飼養環境等多因素影響，春季易發情，因而我們選擇春季配種，觀察雌兔的外生殖器判斷是否發情，外生殖器紅、腫、分泌物多提示發情，遂予以配種，為排除雄性生育力對實驗結果的影響，選擇了5只新西蘭雄性種兔配種,隨機分配到不同母兔。新西蘭大白兔作為嚙齒類動物，性交會刺激排卵。妊娠期一般為31-32d，但也可能在29-35d之間。交配后9-12d摸胎，以判斷是否成功受孕，未懷孕的母兔再次交配,并于交配后9-12d進行新一輪的摸胎。摸胎判斷懷孕后的母兔一半于交配后12-16d取出子宮觀察胚胎數，剩余的飼養至自然分娩。即各組取5只用于觀察著床胚胎數，5只用于觀察分娩數并記錄。

1.5 統計學處理 所有研究數據以 SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，Kolmogorov-Smirnov法檢測數據的正態性；符合正態分布的計量資料采用均數±標準差的形式表示，兩個以上樣本均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；不符合正態分布的計量資料以中位數 P50(P25,P75)形式表示，組間比較采用非參數檢驗。以P＜0.05（雙側）視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兔子宮內膜形態學結果

2.1.1 HE結果 HE染色后我們可以看到兔子宮內膜由覆蓋有柱狀上皮細胞的息肉樣突起構成，大多數腺體位于基底層和粘膜下（見圖2）。3組術后7d、14d、28d的子宮內膜腺體數均符合正態分布，采用單因素方差分析比較組間差異，結果顯示：在術后7d和14d，子宮內膜腺體數在3組間存在顯著性差異，LSD兩兩檢驗顯示電熱組腺體數顯著少于機械組和對照組，機械組和對照組差異沒有顯著性。在術后28d，3組的子宮內膜腺體數無顯著差異。見表1。術后7d兔子宮的HE染色圖（圖2-A：電熱組，圖2-B:機械組，圖2-C:對照組），術后14d兔子宮的HE染色圖（圖2-D：電熱組，圖2-E:機械組，圖2-F:對照組），術后28d兔子宮的HE染色圖（圖2-G：電熱組，圖 2-H:機械組，圖2-I:對照組）

圖2 各組兔子宮在不同術后時間段的HE染色圖片

表1 各組兔子宮內膜在不同術后時間段的腺體數

2.1.2 Masson結果（圖3）Masson染色后，子宮內膜的膠原纖維染成藍色，粘膜、血管、內膜腺體和肌肉染成紅色。雖然宮腔里沒有觀察到粘連帶，但是在第7d可以從Masson染色的切片上發現電熱損傷組中間質內腺體明顯減少，膠原纖維明顯增多，藍染加重，排列紊亂，藍染區域的比例明顯高于機械損傷組和對照組 （見圖3）。3組術后7d、14d、28d的子宮內膜藍染區比例均符合正態分布，采用單因素方差分析比較組間差異，結果顯示：在術后7d和14d，子宮內膜藍染區比例在3組間存在顯著性差異，LSD兩兩檢驗顯示電熱組腺體數顯著高于機械組和對照組。在術后28d，電熱組內膜已基本恢復，3組的子宮內膜藍染區比例無顯著差異。見表2。

圖3 各組兔子宮術后7d的MASSON染色圖片（圖3-A：電熱組，圖3-B:機械組，圖3-C:對照組）:顯示術后7d電熱組子宮內膜的纖維化面積（藍染區）明顯大于機械組和對照組

表2 各組兔子宮內膜在不同術后時間段的纖維化面積比

2.2 生育力結果（見圖4，表3，表4） 第一輪交配后86.6%的雌兔受孕（30只雌兔中26只受孕），剩下未受孕的雌兔進行第二輪交配后全部受孕。3組術后的著床胚胎數及分娩仔兔數均符合正態分布，采用單因素方差分析比較組間差異，結果顯示：著床胚胎數及分娩仔兔數在3組間存在顯著性差異，P<0.05,LSD兩兩檢驗顯示電熱組的著床胚胎數（5.600±2.302 枚）及分娩仔兔數（5.200±1.923 只）顯著低于機械組（11.400±1.516 枚，10.200±1.923 只）和對照組（10.400±1.673 枚，10.400±2.073只），P<0.05,機械組和對照組相比，差異無統計學意義，P>0.05。 見表3，表4。

圖4 兔子宮著床胚胎圖片圖4-A:電熱組，圖4-B機械組，圖4-C對照組。電熱組(配種后14d)著床胚胎數明顯少于機械組(配種后12d)和對照組(配種后14d)

表3 各組著床胚胎數柱狀圖

表4 各組分娩仔兔數柱狀圖

3 討論

在臨床操作中，由于宮腔搔刮或者宮腔鏡手術中電損傷造成的宮腔損傷包括可視的粘連帶、纖維疤痕的形成，或子宮內膜薄。本研究中，我們采用新西蘭大白兔構建宮腔內膜損傷動物模型，分電熱損傷組、機械損傷組和對照組，無論是電熱損傷組還是機械損傷組都沒有發現肉眼可見的粘連帶，這也與許多已有的研究相符合[7,8]，這可能源于兔強大的子宮內膜修復能力，有研究報道子宮內膜損傷動物模型即便沒有觀察到粘連帶也是有意義的，因為和人類宮腔粘連患者一樣，這代表了一種病理狀態，對胚胎的著床有負面影響[9]。本研究組分電熱損傷組、機械損傷組和對照組，分別應用HE染色、Masson染色、著床胚胎數、分娩仔兔數等多角度評估建模效果，研究發現術后7d和14d，與機械損傷組和對照組比較，電熱損傷組子宮內膜腺體數量顯著減少（P＜0.05），內膜纖維化面積顯著增大 （P＜0.05），差異有統計學意義；術后28d 3組比較內膜腺體數及纖維化面積，差異無統計學意義(P>0.05)。與機械損傷組和對照組比較，電熱損傷組著床胚胎數更少，分娩的仔兔更少，差異有統計學意義（P<0.05）。 術后 7d、14d、28d 機械組與對照組比較內膜腺體數及纖維化面積，差異無統計學意義(P>0.05)，且機械組和對照組比較，著床胚胎數及分娩仔兔數也沒有統計學差異 (P>0.05)。因而與機械損傷相比，在損傷后7-14d，電熱損傷造成的兔宮腔內膜損傷模型更穩定有效。

既往成功建立宮腔內膜損傷模型的報道不多。有研究通過單一的宮腔搔刮來建立宮腔內膜損傷模型，但是往往在術后7d[10]或者28d[11]，子宮內膜就完全復原了，因而通過單一的機械搔刮很難獲得理想的兔宮腔損傷模型，這也與我們的研究結果相符合。本研究中我們發現，單純宮腔搔刮后7d、14d、28d機械組與對照組比較內膜腺體數及纖維化面積，差異無統計學意義(P>0.05)，且機械組和對照組比較，著床胚胎數及分娩仔兔數也沒有統計學差異 (P>0.05)。無論從HE染色還是masson染色都發現術后7d兔子宮內膜就基本恢復正常，與對照組無顯著差異，這可能緣于兔強大的子宮內膜修復能力，單純的宮腔搔刮無法有效的獲得宮腔內膜損傷模型。

還有一些研究通過多種宮腔損傷的方法來造模。Nesrine Ebrahim等通過宮腔內注射三氯乙酰造模[12]，Liangjun Xia等則是在宮腔內注射95%乙醇[13],Xiangzhen Wang等應用的是宮腔內注射苯酚凝膠的方法[14]，Basak Büyük等通過經陰道宮腔內注射三氯乙酸[15]。陳芳等切除兔雙側卵巢后機械刮宮[16]，Liu等[11]在子宮搔刮后放置脂多糖浸泡過的棉線，通過機械損傷和感染相結合的方法造模。Yi Zhu等采用搔刮后宮腔注射脂多糖的方法[17]。Li等在子宮搔刮后放置銅線，并發現這樣操作造成的子宮損傷阻礙了胚胎的著床[18]，然而該方法整個造模周期長達一月余。這些方法具有耗時長，操作繁瑣的缺點，且與臨床上宮腔損傷的形成原因相差甚遠。

因而為確立簡單、高效、易行的建模方法，本研究中我們研究了電熱損傷的造模方法。電熱損傷術后7-14d對子宮內膜形態及生育力的評估結果,說明電熱損傷在術后7-14d對子宮內膜造成損傷和生育力下降是確定有效的，已有多項臨床研究證實宮腔內操作會影響生育力[19,20,21]。此外，隨著宮腔鏡手術的推廣應用，越來越多電刀的應用，例如子宮內膜息肉的電切、子宮粘膜下肌瘤的電切、宮腔粘連的電切等,也使得該動物模型尤其適用于研究電熱對子宮內膜和生育力損傷的相關研究。

已有的研究中，通常通過增加的纖維化面積和減少的腺體數量來作為宮腔內膜損傷動物模型建立的衡量指標[11,7,22]。本研究中我們除了記錄腺體的多少、纖維化面積外，還將實驗對象的生育結局（包括著床胚胎數和分娩仔兔數）納入了研究范圍，毫無疑問，最終的生育結局是最有說服力、最直觀也是臨床最關注的。

目前用于子宮內膜損傷模型的動物主要為大鼠[23]、小鼠[22,23,24]、新西蘭兔[7,11]及少數靈長類動物。非人靈長類動物如恒河猴、狒狒等與人類最接近，具有與人類相似的月經周期、基因序列及生殖解剖生理等特征，但其屬于國家保護動物，會引起倫理學問題，而且獲取困難、價格昂貴，耗費大量的人力、物力和財力，因而難以推廣使用。而相較于大鼠小鼠而言，新西蘭大白兔子宮更大，視野更清晰，手術操作更方便，且兔屬于嚙齒類動物，基本處于永久發情期，交配后即可排卵[20]，這也使得本研究中,所有實驗動物宮腔受損后的交配和排卵時間間隔相同,這些特點使得兔成為了較為理想的研究宮腔內膜損傷的動物模型。已有的研究會利用兔的雙角子宮的特點，一側子宮作為研究組，一側子宮作為對照組，然而在實際工作中，往往在手術造模后，許多實驗動物腹腔由于手術的刺激會在術后發生不同程度的盆腹腔粘連,以至解剖結構不清，進而難以分清研究側與對照側子宮，故本研究中擯棄這一分組設計，對兔雙側子宮手術造模，以獨立的動物個體作為研究對象和對照對象。

然而，我們的研究仍有一些不足的地方。首先，樣本量小，我們需要更大的樣本量來證明我們的結論。其次，臨床上宮腔內膜損傷會導致不孕，宮內發育受限、反復流產等[1]，因此胚胎及胎盤的大小、流產率，都是有意義的評價指標，受樣本量的限制，這些都未納入本研究。

在本研究中，我們建立了一個宮腔內膜損傷模型，雖然沒有觀察到粘連帶，但是可以確定的是電熱損傷宮腔內膜的有效性，且在損傷后7-14d確實影響了生育力，這為研究宮腔內膜損傷提供了有效可信的動物模型。該模型的建立可以從基因、蛋白以及干細胞等多個角度深入研究內膜損傷的發病機制，而且可以作為一個平臺從細胞因子、生物材料以及干細胞移植等方面探求新的治療方法并檢測其有效性及安全性。