順德地區12237例新生兒遺傳性耳聾基因突變分析

魏楚洪 張金鳳 曾 娜 文 芳 張 靜 鄧惠英 麥富巨 郭潤民，3， 曾巧莉

1.廣東醫科大學順德婦女兒童醫院（佛山市順德區婦幼保健院）新生兒疾病篩查中心，廣東佛山 528300；2.廣東醫科大學順德婦女兒童醫院（佛山市順德區婦幼保健院）檢驗科，廣東佛山 528300；3.廣東醫科大學順德婦女兒童醫院（佛山市順德區婦幼保健院）內科，廣東佛山 528300；4.廣東醫科大學順德婦女兒童醫院（佛山市順德區婦幼保健院）婦幼研究所，廣東佛山 528300

聽力障礙是最為常見的先天性缺陷之一，居各類先天性遺傳疾病之首，約占全部出生缺陷的20%左右[1]，其中75%～80%為常染色體隱性遺傳。目前，已經有許多與遺傳性聾相關的基因被定位，其遺傳性致聾易感基因有100 種，常見的遺傳性致聾易感基因有15 種[2]。開展15 種常見的遺傳性耳聾基因突變檢測對在分子水平明確耳聾病因具有重要意義，同時可為廣東省順德地區遺傳性致聾易感基因診斷和預防、遺傳咨詢提供實驗室數據支持。本實驗采用基因芯片法對12 237 例新生兒遺傳性耳聾基因突變進行檢測分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年6 ～10 月在順德區各助產機構出生的活產新生兒12 237 例，其中男嬰6420 例（52.46%），女嬰5817 例（47.54%），釆血時間為出生后3 ～7d，本研究所有新生兒監護人簽署知情同意書，并經醫院醫學倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 取血樣 所有新生兒出生后72h 均按衛生部《新生兒疾病篩查血片采集技術規范》采集嬰兒足跟血，填寫相關的信息卡（母親姓名、住院號、居住地址、聯系電話、新生兒性別、孕周、出生體重、出生日期及采血日期等），其主要步驟：（1）按摩或熱敷新生兒足跟，并用75%酒精消毒皮膚；（2）使用一次性采血針刺足跟內或外側，深度＜3mm，用干棉球拭去第一滴血，取第二滴血；（3）將濾紙片接觸血滴，切勿觸及足跟皮膚，使血自然滲透至濾紙背面，至少采集三個血斑，每個血斑直徑＞8mm；（4）將血片平置于清潔空氣中，避免陽光直射，自然晾干呈深褐色，血斑無污染；（5）將檢查合格的濾紙干血片，置于塑料袋內，保存在2 ～8℃冰箱中備檢；（6）在3d 內將濾紙干血片運送至北京博奧醫學檢驗順德分公司進行新生兒遺傳性耳聾基因突變檢測。

1.2.2 DNA 提取

1.2.2.1 器材與方法 （1）用打孔器（杭州博圣生物技術有限公司）：用于取直徑為6mm 的干血斑1片至1.5mL 離心管（泰興市博美醫療器械廠）；（2）低溫離心機：湘儀TGL-16K 臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；（3）檢測試劑盒：北京天根生化科技有限公司；（4）步驟：嚴格按試劑盒使用說明提取外周血基因DNA。

1.2.2.2 質量控制 應用Thermo NanoDrop 2000 微量紫外分光光度計（北京科譽興業科技發展有限公司）測定DNA 濃度/純度，滿足濃度2 ～20ng/μL，純度A260/A280=1.7 ～2.0，儲存于HYCD-282 驗室醫學用冰箱（青島海爾集團有限公司）-20℃備用。

1.2.3 基因突變位點檢測

1.2.3.1 檢測范圍 4 個耳聾基因15 個常見突變位點，分別為：（1）GJB2：176del16 雜合突變型、235delC 雜合突變型、299delAT 雜合突變型、35delG雜合突變型。（2）GJB3：538C ＞T 雜合突變型。（3）SLC26A4：2168 A ＞G 雜合突變型、IVS7-2 A ＞G純合突變型、1174 A ＞T 雜合突變型、1226 G ＞A雜合突變型、1229C ＞T 雜合突變型、1975 G ＞C雜合突變型、2027 T ＞A 雜合突變型、IVS15+5 G＞A 雜合突變型。（4）線粒體12SrRNA：1494 C ＞T均質突變型、1555 A ＞G 均質突變型。

1.2.3.2 應用微陣列芯片法檢測 （1）樣品DNA PCR 擴增：PCR 反應體系合計為20.0μL，主要包括PCR 擴增引物混合物12.5μL、新生兒樣品DNA提取物3.0μL 和PCR 擴增試劑混合物4.5μL，把PCR 反應體系加熱到95℃，變性5min，立即取出浸入到冰水混合物中冰浴3min，取2.5μL 的PCR 產物，加入含有10μL 的雜交緩沖液管內，把混合液加至15 項遺傳性耳聾基因檢測芯片的點樣區域，接著加蓋玻片，最后再封閉雜交倉，并放入到溫度為50℃的雜交儀內孵育1h 后取出芯片，放進洗干機內進行洗滌并快速甩干備用。（2）掃描芯片：運用晶芯LuxScan 10K 微陣列芯片掃描儀及配套軟件（北京博奧晶典生物技術有限公司）進行對應的遺傳性耳聾基因檢測芯片的讀取和結果判斷確認。（3）質量控制：每批次均設置陰性質控和陽性質控，試劑盒由北京博奧生物集團有限公司提供，步驟嚴格按試劑盒使用說明操作，檢測服務由北京博奧生物集團有限公司提供。

表1 不同類型耳聾易感基因陽性率比較

表2 347例耳聾基因陽性新生兒聽力初篩結果

1.2.4 聽力初篩 新生兒出生后采用耳聲發射（OAE）進行聽力初篩，初篩結果以“通過”“不通過”表示，不通過初篩的新生兒于出生42h 后回醫院體檢復查時進行聽力復篩，未通過復篩的新生兒于3個月后到五官科進行聽力學診斷。

2 結果

2.1 各類耳聾易感基因篩查情況

12 237 例新生兒遺傳性耳聾基因突變檢測陽 性 共 有347 例 占2.84%（347/12 237），其 中GJB2 235delC 雜合突變型基因為157 例占總陽性45.24%（157/347），SLC26A4 IVS7-2 A ＞G 純 合突變型基因89 例占總陽性25.65%（89/347），線粒體12SrRNA 1555A ＞G 均質突變型基因陽性19 例占總陽性5.48%（19/347），SLC26A4 1229C ＞T 雜合突變型基因陽性18 例占總陽性5.19%（18/347），GJB2 299delAT 雜合突變型基因陽性17 例占總陽性4.90%（17/347），SLC26A4 2168A ＞G 雜合突變型基因陽性11 例占總陽性3.17%（11/347），GJB3 538C ＞T 雜合突變基因陽性為10 例占總陽性2.88%（10/347），其他少見類型突變基因陽性共26例占總陽性7.49%（26/347），其中同時具有2 種基因突變者為4 例占總陽性1.16%（4/347），見表1。

2.2 聽力篩查情況

運用耳聲發射方法對12 237 例新生兒進行聽力初篩，結果初篩單側不通過或雙側同時不通過例數為235 例，聽力初篩陽性率1.92%（235/12 237），聽力初篩通過率為98.08%（12 002/12 237）。347例耳聾基因突變陽性新生兒聽力篩查顯示“未通過”的有12 例：GJB2 235delC 雜合突變型8 例占陽性突變2.30%（8/347），聽力初篩陽性基因突變檢出率3.40%（8/235）、SLC26A4 IVS7-2A ＞G 雜合突變型3 例占陽性突變0.86%（3/347），聽力初篩陽性基因突變檢出率1.28%（3/235）、SLC26A4 1229 C ＞T 雜合突變型1 例占陽性突變0.29%（1/347），聽力初篩陽性基因突變檢出率0.43%（1/235），見表2 ～3。

3 討論

常見耳聾基因突變位點檢測有助于明確聽力障礙患兒的遺傳學病因，并能提早發現遲發性耳聾，避免藥物性耳聾，以達到預防后天耳聾發生的目的；初篩耳聲發射是一種聲能量，它產生于耳蝸，并經過聽骨鏈和鼓膜傳導到外耳道，只有在中耳功能正常的前提下才能檢測到此聲信號；初篩耳聲發射的臨床意義為提供了一條檢測耳蝸放大功能和外毛細胞功能完整性的途經，但它并不能檢測出聽覺中樞及神經傳導通路有無病變；據了解，約1/800 ～ 1/1000 的新生兒在出生時有嚴重的聽力障礙，而出生后1 年內是小兒聽覺中樞及語言發育的最關鍵時期，此時若得不到早期診斷及相應的干預治療，兒童可能出現聽力殘疾。對此，衛生部提出把新生兒聽力篩查作為保健的常規檢查，其中耳聲發射是新生兒聽力篩查的常用方法，耳聲發射包括瞬態誘發耳聲發射（TE）和畸變產物耳聲發射（DP），將兩者結合起來可以避免漏篩，對聽力障礙患兒做到早發現、早干預。目前已有一種TE+DP 型二合一耳聲發射篩查儀可篩查聽力障礙，該儀器在小兒處于睡眠狀態下進行，只需3 ～5min 即可完成檢查，無創傷，無痛苦，有助于聽力障礙患兒早發現、早診斷、早治療。

表3 12例未通過聽力篩查耳聾基因突變陽性結果

本研究中受檢的12 237 名新生兒中檢出致聾基因突變攜帶者347 例，總攜帶率為2.84%，雖然順德地區致聾基因突變總攜帶率比成都地區（總攜帶率為3.19%）低[3]，成都地區及順德地區均是使用博奧生物有限公司提供的微陣列芯片法檢測4 個耳聾基因15 個耳聾基因突變位點，包括GJB2 基因（35delG、176del16、235delC、299delAT）、GJB3基 因（538C ＞T）、SLC26A4 基 因（IVS7-2A ＞G、2168A ＞G）、線 粒 體DNA 12SrRNA 基 因（1555A＞G、1494C ＞T）；GJB2 基因突變引起的耳聾為常染色體隱性遺傳，其中GJB2 235delC 和GJB2 35delG/176del16 分別為猶太人、東亞人和高加索人群最常見的突變位點[4]；本研究中我們檢出攜帶GJB2 基因突變者180 例，占所有致聾基因攜帶人群的51.87%，其突變攜帶率為1.47%，其中235delC 突變者159 例，突變攜帶率1.30%，在GJB2 基因突變中占88.33%，這遠高于67.7%的Dai 等[5]報道結果，不同地區的突變率不盡相同，其次是299delAT 和176del16突變者20 例，突變攜帶率為0.16%，在GJB2 基因突變中占11.11%，GJB2 是發病率最高的遺傳性致聾基因，GJB2 雜合突變者具有高度的遺傳易患性，本研究結果發現GJB2 235del C 突變位點為最常見位點，這與國內的研究文獻報道GJB2 基因突變是我國非綜合征型感音神經性耳聾的主要致病基因相一致[6-7]；耳聾患者的螺旋神經節細胞數量正常，適合人工耳蝸植入，此類患者在耳蝸植入后，言語理解能力強，預后良好。因此，明確GJB2 基因突變致聾的分子病因學原因對新生兒遺傳性致聾治療和預后具有重要意義。

SLC26A4 基因突變引起的耳聾為常染色體隱性遺傳，可引起非綜合征或綜合征型大前庭水管伴感音神經性耳聾，但是在各國和各地區之間存在差異，Tsukada 等[8]報道在美國患者中該突變基因的檢出率為20%，東亞地區檢出率為5.5%～12.6%，西班牙檢出率為27%，法國為40%；本研究中我們檢出SLC26A4 基因突變者139 例，占所有致聾基因攜帶人群的40.06%，其突變攜帶率為1.14%，是僅次于GJB2 基因突變導致感音神經性耳聾的遺傳性病因[9]，其中SLC26A4 IVS7-2 突變者90 例，突變攜帶率0.74%，在SLC26A4 基因突變中占64.75%，患兒感冒、頭部輕微撞擊、潛水等外界因素均可導致聽力的下降，因此對SLC26A4 基因的篩查，可明確診斷，提示對耳聾高危患兒采取嚴格的防護措施，保護聽力免受外界因素影響。

線粒體12SrRNA 基因為母系遺傳性基因，對氨基糖苷類抗生素耳毒性具有高度的敏感性，本研究中線粒體12SrRNA 基因突變者22 例，占所有致聾基因攜帶人群的6.34%，突變攜帶率0.18%，線粒體12SrRNA 基因突變率極低，明顯低于我國線粒體12SrRNA 基因4.4%的攜帶率[10]。

在正常人群中GJB3 基因的突變頻率比較小，胡華梅等[11]未發現GJB3 基因的突變。但在本研究中，檢出GJB3 基因突變者10 例，占所有致聾基因攜帶人群的2.88%，突變攜帶率0.08%，GJB3 基因突變屬于散發性耳聾患病，也要引起高度重視。

本研究運用耳聲發射方法對新生兒進行聽力初篩，結果初篩單側或雙側同時不通過為235 例，不通過率為1.92%，稍高于北京市不通過率1.35%[12]；其中因基因突變引起聽力篩查不通過占5.11%，未通過聽力篩查的新生兒是攜帶耳聾基因突變的高危人群，應引起各臨床工作者的高度重視[13]，并對患兒家屬進行遺傳性耳聾相關知識的宣教及育兒指導；Norris 等[14]研究發現，攜帶有GJB2 純合突變基因型的新生兒患兒最終確診聽力損失的時間大部分發生在出生后12 ～60 個月，對攜帶有耳聾基因突變的新生兒應定期進行聽力學檢測，密切關注其聽力變化情況，定期監測，早期診斷，積極治療原發病，對聽力改善是有很大意義[15]。

綜上所述，廣東省順德地區新生兒遺傳性耳聾基因突變攜帶以GJB2 突變基因及SLC26A4 突變基因為主，線粒體12S rRNA 基因及GJB3 基因突變均有散發性，本次篩查發現的8 例GJB2 雜合突變型、1 例GJB2 基因純合突變和3 例SLC26A4 雜合突變型新生兒，聽力篩查均“不通過”，進行新生兒遺傳性耳聾基因突變篩查和分析，有助于發現高發突變類型，聯合聽力篩查可以有效提高新生兒遺傳性耳聾病的檢出，對進一步遺傳學研究有指導意義，對本地區遺傳性耳聾疾病的早發現、早診斷和早干預具有重要的臨床意義。