全切片圖像掃描技術(shù)在病理切片質(zhì)控中的作用

唐仲平 崔權(quán)哲 包 驥 蔡 瑋 趙 春▲

1.成都市第一人民醫(yī)院病理科，四川成都 610041；2.成都市第三人民醫(yī)院病理科，四川成都 610014；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院病理研究室，四川成都 610041；4.四川省雅安市名山區(qū)人民醫(yī)院病理科，四川雅安 625100

數(shù)字病理核心是將傳統(tǒng)病理圖像電子化和網(wǎng)絡(luò)化，其關(guān)鍵技術(shù)包括全切片圖像掃描技術(shù)（whole slide images，WSI）、圖像分析信息學(xué)、信息管理系統(tǒng)和數(shù)字化體外診斷（IVD）設(shè)備。目前，數(shù)字病理的用途主要包括四類：教學(xué)[1-2]、診斷[3-8]、研究和檔案保存[9]。數(shù)字病理剛興起時(shí)由于掃描慢、圖像差、傳輸慢、存儲(chǔ)貴，只用于部分病理教學(xué)實(shí)踐及少數(shù)疑難病例或術(shù)中冰凍的遠(yuǎn)程會(huì)診[10-11]。然而以上幾點(diǎn)技術(shù)因素在最近均獲得了顯著進(jìn)步，所以數(shù)字病理在近年推廣至日常臨床診斷是可行的[12-14]。利用WSI技術(shù)將每天產(chǎn)生的所有切片掃描形成數(shù)字化切片。本研究以成都市第一人民醫(yī)院病理科日常工作中連續(xù)診斷的300 例組織學(xué)病例為對(duì)象，由作者在電腦屏幕上閱讀數(shù)字化切片并評(píng)估掃描效果，回顧性分析WSI 技術(shù)在日常病理切片的數(shù)字化掃描中的應(yīng)用效果及本科室HE 切片的主要質(zhì)量缺陷，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，本研究選取成都市第一人民醫(yī)院病理科300 例[共計(jì)493 張病理切片：384 張?zhí)K木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色切片，57 張亞甲基藍(lán)染色切片，52 張免疫組化染色切片]由作者于2015 年9 月診斷的連續(xù)組織學(xué)病例為研究對(duì)象，其中男115 例，女185 例，年齡10 ～92 歲，平均（45±15）歲。

表1 病理常規(guī)石蠟包埋HE染色切片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)分[15]

圖1 WSI 技術(shù)掃描不同類型的切片得到的數(shù)字化圖像

1.2 病理檢查

本研究病例來自消化系統(tǒng)155 例（60 例胃鏡，33 例腸鏡，62 例開展其他方式檢查），乳腺及女性生殖系統(tǒng)82 例（13 例乳腺，4 例子宮，27 例宮內(nèi)膜，20例宮頸及宮頸管，8 例輸卵管，3 例卵巢，2 例外陰，5 例胎盤），皮膚34 例，軟組織與骨10 例，泌尿系統(tǒng)與男性生殖器官7 例，頭頸部7 例，造血與淋巴組織3 例，肺、胸膜、胸腺及心臟2 例。

1.3 方法

將病理切片運(yùn)用Aperio 全自動(dòng)數(shù)字切片掃描系統(tǒng)（美國Aperio Technologies 公司）掃描成數(shù)字化切片（20 倍物鏡）。按照HE 切片評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)字化切片做出質(zhì)量評(píng)分。見表1。

2 結(jié)果

2.1 WSI技術(shù)掃描前及掃描中發(fā)現(xiàn)的問題及應(yīng)對(duì)措施

在掃描切片前的提片過程中，作者發(fā)現(xiàn)2 張粘連的切片和1 張缺失的切片。對(duì)此，作者將2 張粘連的切片放入二甲苯中浸泡過夜，第二天將其分離并去除蓋玻片后重新封片；對(duì)于缺失的切片作者提取其原始蠟塊重新切片。493 張切片備齊后，作者在掃描過程中發(fā)現(xiàn)5 張切片因自動(dòng)對(duì)焦失敗而無法掃描。對(duì)此，作者在病理組織上手動(dòng)選取4 個(gè)以上焦點(diǎn)來解決該問題。

表2 HE切片的十項(xiàng)優(yōu)質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的得分

2.2 WSI技術(shù)的掃描優(yōu)良率

在用WSI 技術(shù)掃描的493 張病理切片中，共有50 張切片的掃描質(zhì)量存在不同程度的問題，總體掃描優(yōu)良率為89.86%（443/493）。常規(guī)HE 染色切片、亞甲基藍(lán)染色切片及免疫組化染色切片的掃描優(yōu)良率分別為89.58%（344/384）、85.96% （49/57）及96.15%（50/52）。見圖1。

2.3 WSI技術(shù)的掃描不良原因及應(yīng)對(duì)措施

筆者將掃描不良的50 張病理切片的原始切片提出來觀察，將掃描不良的原因分為五大類：切片不整潔、封片劑收縮、切片裱貼位置不當(dāng)、切片過厚和掃描機(jī)原因，它們?cè)趻呙璨涣嫉那衅姓嫉谋戎胤?別 為44.00%（22/50），22.00%（11/50），10.00%（5/50），6.00%（3/50），18.00%（9/50）。針 對(duì) 上 述五類問題，作者采取了擦拭灰塵，重新封片，重切薄片和調(diào)試機(jī)器等措施，結(jié)果50 張切片重新掃描后全部得到了清晰的數(shù)字化圖像。

2.4 我科HE切片的優(yōu)良率

筆者將384 張HE 切片按照HE 染色切片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)分表的十項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)依次評(píng)分，計(jì)算出最終得分，并按照切片質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我科沒有不合格HE 切片且切片的總體優(yōu)良率較高（99.74%），其中評(píng)“優(yōu)”率為94.27%（362/384），評(píng)“良”率為5.47%（21/384），僅有的1 張?jiān)u“基本合格”的HE 切片來自造血和淋巴系統(tǒng)。評(píng)“良”的21 張HE 切片分別來自乳腺及女性生殖系統(tǒng)（38.09%，8/21：宮內(nèi)物4 張，胎盤2 張，宮頸1 張，輸卵管1 張），皮膚（19.05%，4/21），消化系統(tǒng)（14.29%，3/21），泌尿系統(tǒng)與男性生殖器官（14.29%，3/21），頭頸部（9.52%，2/21），造血與淋巴系統(tǒng)（4.76%，1/21）。

2.5 我科HE切片的主要質(zhì)量缺陷

我科384 張HE 切片的得分范圍在74 ～100分之間，平均得分為96.269 分，平均扣分為3.731分。按照HE 染色切片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，我科HE 切片的十項(xiàng)優(yōu)質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的得分情況見表2。其中，單項(xiàng)平均扣分/總平均扣分大于10.00%的因素包括以下四項(xiàng)：刀痕或裂隙（35.03%），皺褶或折疊（17.45%），切片松散或裱貼位置不當(dāng)（13.61%），切片厚或厚薄不均（12.09%）。

為了進(jìn)一步分析我科HE 切片的主要質(zhì)量缺陷，作者將HE 染色切片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)分表中的質(zhì)量缺陷減分進(jìn)一步拆分成十八個(gè)減分項(xiàng)目。如表3 所示，384 張HE 切片共計(jì)扣分為1433 分，按所扣分?jǐn)?shù)的多少排序，五個(gè)主要的扣分原因依次為裂隙（26.80%），折疊（14.65%），切片裱貼位置不當(dāng)（9.77%），刀痕（8.23%），切片厚薄不均（7.26%）。如表4 所示，384 張HE 常規(guī)病理切片共計(jì)扣分項(xiàng)目為519 項(xiàng)（注：同一張切片可有多個(gè)項(xiàng)目被扣分），按照扣分項(xiàng)目的多少排序，五個(gè)主要的扣分原因依次為裂隙（36.99%），折疊（20.23%），刀痕（11.37%），切片裱貼位置不當(dāng)（5.39%）， 切片厚薄不均（5.01%）。綜合表3 ～4 的數(shù)據(jù)，我科HE 切片的主要質(zhì)量缺陷集中在裂隙，折疊，刀痕，切片裱貼位置不當(dāng)和切片厚薄不均五個(gè)問題上。

3 討論

與傳統(tǒng)病理相比，數(shù)字病理運(yùn)用大數(shù)據(jù)手段促進(jìn)病理學(xué)研究[16-19]。只有數(shù)字病理進(jìn)入日常病理診斷工作，那臨床的大數(shù)據(jù)研究才得以開展。但目前國內(nèi)外的數(shù)字切片并未真正用于病理科日常診斷工作，病理醫(yī)生依然習(xí)慣在顯微鏡下而非電腦屏幕上進(jìn)行診斷，這使得病理學(xué)的發(fā)展很難廣泛利用現(xiàn)在蓬勃發(fā)展的信息技術(shù)。本研究運(yùn)用WSI 技術(shù)將300 例連續(xù)的組織學(xué)病例的病理切片進(jìn)行數(shù)字化掃描，并由作者閱讀數(shù)字化切片評(píng)估掃描效果，分析WSI 技術(shù)在日常病理切片的數(shù)字化掃描中的應(yīng)用效果。

表3 HE切片所扣分?jǐn)?shù)的分布情況

表4 HE切片扣分張數(shù)的分布情況

在切片提取過程中，作者發(fā)現(xiàn)兩個(gè)問題：（1）有2 張相鄰切片因封片膠過多，而檔案管理員在切片未充分干燥時(shí)就將切片重疊放在切片柜中而導(dǎo)致切片粘連，無法分開；（2）有1 張切片因未及時(shí)歸檔或歸檔錯(cuò)誤，導(dǎo)致無法在相應(yīng)位置找到切片。這反映了檔案管理員在歸檔病理資料時(shí)的工作疏忽。雖然數(shù)量不多，但以后檔案管理員一定要在切片充分干燥后將病理切片及時(shí)正確地歸檔。

在掃描過程中，作者發(fā)現(xiàn)5 張切片因組織太小導(dǎo)致焦點(diǎn)數(shù)目少于4 個(gè)，或焦點(diǎn)選在錯(cuò)誤的位置（非有效區(qū)域）而不在組織上，掃描機(jī)無法自動(dòng)對(duì)焦而掃描失敗。最主要的原因是臨床醫(yī)生取材過少，所以病理科要經(jīng)常與臨床科室聯(lián)系，請(qǐng)臨床醫(yī)生盡可能取足夠的組織供病理醫(yī)技人員制片和診斷。其次，可能是病理技師包埋方向不當(dāng)或修片不夠，未將組織最大面完整地展示出來，所以病理醫(yī)生閱片時(shí)若發(fā)現(xiàn)組織過小，要請(qǐng)病理技師重新包埋組織或深修蠟塊，以暴露組織的最大面。

在用WSI 技術(shù)掃描的493 張病理切片中，共有50 張切片的掃描質(zhì)量存在不同程度的問題，原因有五大類。（1）切片不整潔：切片上灰塵過多，而灰塵跟病理組織不在同一個(gè)平面，導(dǎo)致掃描機(jī)將灰塵聚焦掃描，而病理組織成像卻模糊不清；（2）封片劑收縮：技師封片時(shí)滴加封片膠過少，導(dǎo)致封片膠回縮，而掃描機(jī)掃描的是組織的單一層面，導(dǎo)致封片膠收縮的區(qū)域掃描不清；（3）切片裱貼位置不當(dāng)：病理切片分為正反兩面，正面的右側(cè)為可以做標(biāo)記的磨砂面，而反面為光滑面。技師撈片時(shí)應(yīng)當(dāng)將石蠟片貼在正面，封片后在正面右側(cè)的磨砂面貼上病理標(biāo)簽。但偶爾技師在撈片時(shí)不慎將石蠟片貼在光滑的反面，封片時(shí)卻在沒有病理組織的正面蓋上蓋玻片，貼上病理標(biāo)簽。而作者往掃描機(jī)里裝載切片時(shí)是根據(jù)標(biāo)簽來判斷切片正反，所以這些撈片錯(cuò)誤的切片被掃描的是沒有病理組織的正面，自然不能得出清晰的圖像；（4）切片過厚：細(xì)胞重疊，精細(xì)的細(xì)胞形態(tài)難以看清；（5）掃描機(jī)原因：傳統(tǒng)病理切片并無質(zhì)量問題，但掃描得出的數(shù)字化切片上卻出現(xiàn)一些明暗相間的條帶，這種情況多出自掃描機(jī)自身原因。其中，切片不整潔、封片劑收縮、切片裱貼位置不當(dāng)這三種原因?qū)?shù)字化切片質(zhì)量的影響是極大的，會(huì)導(dǎo)致病理醫(yī)生無法根據(jù)數(shù)字化切片做出診斷；而切片過厚和掃描機(jī)原因會(huì)導(dǎo)致病理醫(yī)師在診斷時(shí)花費(fèi)更多時(shí)間，診斷正確率也會(huì)有所下降。

針對(duì)上述五類問題，作者采取了以下措施。（1）對(duì)于不整潔的切片，用干凈的棉布蘸適量的無水酒精將灰塵擦拭干凈；（2）對(duì)于封片劑收縮的切片，將其放入二甲苯中浸泡過夜，第二天去除原蓋玻片后重新封片；（3）對(duì)于裱貼位置不當(dāng)?shù)那衅?，將其放入二甲苯中浸泡過夜，第二天去除原來在載玻片正面的蓋玻片后，重新在載玻片反面的組織上重新封片。值得注意的是，切忌保留原來在載玻片正面的蓋玻片，而直接在載玻片反面的組織上重新封片。雖然這樣的切片在顯微鏡下可以看清，但整個(gè)切片太厚，會(huì)導(dǎo)致切片無法插入掃描儀的切片槽，或者掃描厚切片時(shí)直接導(dǎo)致機(jī)器故障；（4）對(duì)于切得過厚的切片，提取原始蠟塊重新切薄片；（5）對(duì)于掃描儀自身造成的問題，聯(lián)系工程師對(duì)掃描儀進(jìn)行調(diào)試校準(zhǔn)。經(jīng)過上述處理后，作者將掃描不良的50 張切片重新掃描，全部得到了清晰的數(shù)字化圖像。實(shí)際上，前四種原因是可以通過病理科醫(yī)技人員自己控制和避免的，只有第五種的掃描機(jī)原因?qū)τ诓±砜乒ぷ魅藛T算是一個(gè)相對(duì)的不可控因素。而493張切片中只有9 張切片（1.83%）是由于掃描機(jī)原因而導(dǎo)致掃描質(zhì)量不佳，這說明運(yùn)用WSI 技術(shù)對(duì)日常病理切片進(jìn)行數(shù)字化掃描有著較高的成功率和可行性。

另外，作者還用WSI 技術(shù)形成的數(shù)字切片進(jìn)行HE 切片的質(zhì)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn)我科HE 切片有著較高的優(yōu)良率（99.74%），僅有1 張基本合格切片，沒有不合格切片。那么我科以后的主要目標(biāo)是將評(píng)“良”的切片提升為評(píng)“優(yōu)”的切片。評(píng)“良”的切片主要來自：乳腺及女性生殖系統(tǒng)8 張（其中4 張為宮內(nèi)物）和皮膚4 張，那么宮內(nèi)物和皮膚是我科制片的難點(diǎn)。宮內(nèi)物切片不理想的主要原因是病理醫(yī)生在一個(gè)取材盒里裝入的組織太多，導(dǎo)致組織脫水不良，技師包埋困難，切片時(shí)難以得到完整的組織切面。所以，病理醫(yī)生應(yīng)當(dāng)將宮內(nèi)膜適量分裝在多個(gè)取材盒里。而皮膚的組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，硬度不一，韌性較大，在切片中常會(huì)出現(xiàn)皺褶，脫片等現(xiàn)象，病理醫(yī)技人員應(yīng)當(dāng)優(yōu)化從取材到制片的整個(gè)流程。

本研究還發(fā)現(xiàn)，我科HE 切片最常見的質(zhì)量缺陷包括裂隙，折疊，刀痕，裱貼位置不當(dāng)和切片厚薄不均五個(gè)方面。下面依次分析這些問題出現(xiàn)的原因，探討解決措施。首先，裂隙的產(chǎn)生主要是因?yàn)榻M織處理的問題。以前我科只有一臺(tái)全封閉式全自動(dòng)脫水機(jī)，只能將所有標(biāo)本混合處理，難免會(huì)出現(xiàn)標(biāo)本處理不均的現(xiàn)象。要么大的組織處理不足，要么小的組織處理過度。切片的裂隙多出現(xiàn)在固定不好、偏小、偏薄的組織，特別是細(xì)胞成分過多、含水量少的組織易被處理過度，導(dǎo)致質(zhì)地硬脆。目前，我科已引進(jìn)一臺(tái)快速脫水機(jī)專門用于小組織的處理，相信這種大小標(biāo)本分開處理的方式會(huì)大大減少裂隙的產(chǎn)生。另外，裱片的水溫過高，切片還來不及伸展，切片的石蠟就已經(jīng)融化，也會(huì)導(dǎo)致組織切片出現(xiàn)人為的裂隙。第二，折疊的產(chǎn)生多因裱片的水溫過低，切片在水中伸展不開。因此，要將裱片的水溫控制在45 ～ 47℃，減少切片人為裂隙和折疊的產(chǎn)生。另外，技術(shù)員的展片不佳也是折疊產(chǎn)生的一個(gè)重要原因，因此技術(shù)員應(yīng)當(dāng)多練習(xí)來提升自己的技術(shù)水平。第三，刀痕的出現(xiàn)可能是由于切片時(shí)刀座不穩(wěn)、使用的一次性刀片松動(dòng)、切片刀鈍、切片角度過于傾斜和切片動(dòng)作太快太猛等，造成切片時(shí)組織出現(xiàn)震顫。所以技術(shù)員在每次切片前要仔細(xì)檢查機(jī)器，擰固刀座，夾緊刀片，調(diào)整并固定切片的角度。第四，裱貼位置不當(dāng)主要是由于病理醫(yī)生取材時(shí)組織取得過大以及技術(shù)員的責(zé)任心不夠。只要病理醫(yī)生取材時(shí)掌握好取材的大小和厚度，技術(shù)員裱片時(shí)將組織片放到玻片中央即可。第五，切片厚薄不均多因切片刀不夠鋒利或切片機(jī)準(zhǔn)確度不高、組織脫水不理想。切片過厚會(huì)導(dǎo)致脫片、脫蠟困難、染色過深，而切片過薄會(huì)導(dǎo)致染色過淺。所以技術(shù)員切片前應(yīng)選擇鋒利的切片刀，平時(shí)勤保養(yǎng)切片機(jī)，保持切片機(jī)的最佳狀態(tài)；經(jīng)常更換脫水液，保持溶液的有效濃度和成分。

更重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)了很多利用數(shù)字化切片做質(zhì)控優(yōu)于傳統(tǒng)質(zhì)控的地方。第一，傳統(tǒng)切片的每次質(zhì)控工作都需要將原始玻璃切片從切片夾中找出，閱片后還需將切片歸檔，即耗時(shí)，又有損壞原始切片的風(fēng)險(xiǎn)；而數(shù)字化切片一旦形成，可隨時(shí)觀看，一勞永逸。第二，傳統(tǒng)切片的質(zhì)控工作必須依賴顯微鏡進(jìn)行，一般只有在病理科才能進(jìn)行；而數(shù)字化切片形成后可經(jīng)網(wǎng)絡(luò)上傳到云端，所以只要有電腦和網(wǎng)絡(luò)的地方都可以完成數(shù)字化切片的質(zhì)控。第三，由于傳統(tǒng)原始切片只有一張，一般同一時(shí)間只能一個(gè)人對(duì)一張切片進(jìn)行質(zhì)控，即使有多頭顯微鏡，同時(shí)進(jìn)行質(zhì)控的人數(shù)也有限制；但數(shù)字化切片可以無限拷貝，可以多人在不同的電腦上同時(shí)觀看進(jìn)行質(zhì)控。第四，傳統(tǒng)切片隨著時(shí)間的延長，部分切片會(huì)出現(xiàn)褪色的現(xiàn)象，會(huì)影響質(zhì)控的評(píng)分；而數(shù)字化切片一旦掃描，永不褪色，無論是對(duì)日后的復(fù)診和質(zhì)控都大有益處。第五，傳統(tǒng)切片如果要用來參與室間質(zhì)控，需要郵寄原始切片，即費(fèi)時(shí)，又費(fèi)錢；而數(shù)字化切片可經(jīng)網(wǎng)絡(luò)快速傳輸?shù)较嚓P(guān)單位，無論是效率還是經(jīng)濟(jì)性都優(yōu)于傳統(tǒng)切片。

總之，本研究論證了WSI 技術(shù)在常規(guī)病理切片的數(shù)字化掃描及質(zhì)量控制工作中的可行性以及優(yōu)勢(shì)。相信在不久的將來，隨著數(shù)字病理進(jìn)入日常病理工作技術(shù)條件的日益成熟，“互聯(lián)網(wǎng)+”全數(shù)字病理科將是未來病理科發(fā)展的必然趨勢(shì)[20-22]。