MADLI-TOF MS和PhoenixTM-100兩種分析儀鑒定腸桿菌科細菌一致性評價

屈晨虹，丁 雨，史偉峰

（蘇州大學附屬第三醫(yī)院a.輸血科；b.檢驗科，江蘇常州213003）

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）對微生物檢測有高效準確的特點，是近年迅速發(fā)展出來的新型質(zhì)譜技術[1-2]。通過基質(zhì)輔助激光解析電離微生物蛋白，檢測飛行時間換算出核糖體蛋白質(zhì)/帶電荷量，對比微生物特征性蛋白數(shù)據(jù)庫進行鑒定。美國BD公司的菲尼克斯100（PhoenixTM-100）已廣泛應用于臨床微生物的鑒定[3-4]，通過周期性監(jiān)測微生物參與的顯色反應和熒光生化反應對細菌進行鑒定，給出置信率90%以上的鑒定結果。

腸桿菌科細菌是臨床感染性疾病中最常見的致病菌，碳青霉烯類藥物被認為是治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β -lactamases,ESBLs)和頭孢菌素酶(AmpC)腸桿菌感染的重要方法。近年來隨著臨床上抗生素的濫用，耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae CRE)所致醫(yī)院感染已經(jīng)爆發(fā)數(shù)次并在全球流行，對該類菌引起的感染盡早診斷和準確治療已成為臨床亟待解決的重要問題[5]。傳統(tǒng)的形態(tài)學、細胞生理學、生化反應鑒定法均難以區(qū)分相似的菌種，快速精準的細菌鑒定結果能及時指導臨床合理使用抗生素，大大延緩耐藥性的產(chǎn)生和蔓延[6]。本次研究目的是評價MALDI-TOF-MS和PhoenixTM-100在鑒定臨床送檢標本中分離出的腸桿菌科細菌一致性，為臨床提供準確鑒定結果，指導合理用藥，有效控制耐藥菌的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2017年1月～2019年8月，在蘇州大學附屬第三醫(yī)院送檢的臨床標本中，分離出的腸桿菌科細菌1 242株，其中腸桿菌屬82株，變形桿菌屬22株，克雷伯菌屬318株，埃希菌屬784株，沙雷菌屬29株，沙門菌屬7株。標本來源：痰液標本491株，血液標本286株，尿液標本160株，無菌體液標本305株。埃希菌屬主要來源于腎內(nèi)科、泌尿科和胃腸外科。克雷伯菌屬主要來源于神經(jīng)外科和重癥醫(yī)學科。其他菌屬的菌株無規(guī)律的分布在免疫風濕科、內(nèi)分泌科、肝膽外科等科室。

1.2 儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；二級生物安全柜購自蘇州安泰公司；PhoenixTM-100細菌鑒定儀及配套試劑和鑒定板、PhoenixSpec比濁儀購自美國BD公司；MALDITOF MS質(zhì)譜儀，IVD細菌標準品，96孔靶板購自德國Bruker公司；MALDI-TOF MS基質(zhì)液，三氟乙酸，無水乙醇，甲酸購自美國Sigma公司；血瓊脂培養(yǎng)平板購自上海科瑪嘉公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液購自杭州濱和試劑公司。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853，金黃色葡萄球菌ATCC25913和糞腸球菌ATCC29212購自美國 Thermo Fisher公司。

1.3 方法 嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行操作，將每份臨床標本進行常規(guī)細菌培養(yǎng)，挑取可疑的單個菌落再次分純培養(yǎng)。將分純后的菌株分別在MALDI-TOF-MS和PhoenixTM-100細菌鑒定儀上進行檢測。運用統(tǒng)計學方法分析評估兩者鑒定結果的一致性。

MALDI-TOF MS進行細菌鑒定時，以Bruker Biotyper系統(tǒng)線性正性模式采集相對分子質(zhì)量2～20kD的蛋白指紋圖譜，與標準數(shù)據(jù)庫進行比對得出匹配分值用以判斷結果。匹配分值＞2.0為鑒定到菌種水平，結果高度可信。匹配分值1.7～2.0為鑒定到菌屬水平，結果可信。匹配分值＜1.7為鑒定結果不可信。本次研究以匹配分值1.7分為界值，未達1.7分視為未檢出結果。

PhoenixTM-100鑒定時須于30min內(nèi)將鑒定板放入已用標準菌株校正過的儀器中檢測。運用儀器內(nèi)置的運算法則，記錄下熒光反應中顏色比率的變化，按照每個測試周期的判讀結果產(chǎn)生“百分比圖”，如取得足夠的信息，則給出鑒定結果。當儀器的判讀結果與數(shù)據(jù)庫中參考菌株的數(shù)據(jù)不一致時，則不能給出鑒定結果。

同一臨床分離菌株分別于兩臺儀器進行鑒定，納入兩臺儀器鑒定到同一菌屬結果的菌株，在同一菌屬中對鑒定到種的菌株進行分組統(tǒng)計。剔除同一患者不同部位的同一菌株。

1.4 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均使用專業(yè)統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0進行分析，計數(shù)配對資料的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為組間比對差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

在臨床分離出的菌株中，MADLI-TOF MS和PhoenixTM-100均鑒定出結果到屬水平的有1 242株，以克雷伯菌屬和埃希菌屬為主。兩儀器在埃希菌屬的鑒定一致率達94.5%，腸桿菌屬的鑒定一致率較低（21.9%），對沙門菌屬的鑒定兩臺儀器都無法準確鑒定到種,見表1。在782株大腸埃希菌種的鑒定上一致率達94.5%，310例肺炎克雷伯菌的鑒定一致率達84.8%，18例奇異變形桿菌的鑒定一致率為100%。在8株肺克臭鼻亞種菌種的鑒定結果上差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.00，P=0.046)，在其他種水平上的鑒定差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表1 MALDI-TOF MS與PhoenixTM-100鑒定結果在屬水平上的比較[n(%)]

3 討論

中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)和江蘇省細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)監(jiān)測結果顯示，腸桿菌科細菌雖對碳青霉烯類抗生素高度敏感，但是CRE菌株的出現(xiàn)使總耐藥率呈逐年上升趨勢[7-8]。隨著臨床多重耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，臨床治療越來越困難，因此對臨床分離菌株的快速、準確的診斷對合理用藥顯得尤為重要。目前，國內(nèi)對于MALDI-TOF MS和PhoenixTM-100兩種鑒定方法的比較并不多見，本研究通過鑒定1 242株臨床分離菌株驗證鑒定結果的可靠性，并對少見菌株進行補充。

表2 MALDI-TOF MS與PhoenixTM-100鑒定結果在種水平上的比較[n(%)]

MALDI-TOF MS對大部分細菌的檢出率都很高，與傳統(tǒng)鑒定方法比較具有較高可靠性，國內(nèi)外許多學者已對其進行了評估[9-10]。但鑒定結果易受客觀因素的影響，如取材部位、菌落特性、培養(yǎng)方式、操作規(guī)范性等。PhoenixTM-100將熒光技術和傳統(tǒng)顯色技術結合，高度自動化受客觀因素的影響較小，但對菌株純度要求較高，且鑒定時間較長。

值得注意的是，兩臺儀器在腸桿菌屬和沙雷菌屬細菌中鑒定到種的檢出率均較低，其他菌屬中鑒定到菌種的檢出率均達90%以上。在肺克臭鼻亞種的鑒定上，PhoenixTM-100準確鑒定出6株，而MALDI-TOF MS僅鑒定出了2株，可見該方法的鑒定嚴重依賴數(shù)據(jù)庫中菌株的種類，需要實驗室在日常工作中對數(shù)據(jù)庫不斷補充和完善[11-12]。在沙門菌屬菌株的鑒定均未能鑒定到種，臨床上對沙門菌屬的鑒定須與生化試驗和血清學試驗相結合[13]。

在同一菌屬的1 242株菌株鑒定中，MALDITOF MS鑒定到種的有1 154株，PhoenixTM-100鑒定到種的有1 138株，兩種儀器都能夠滿足臨床常規(guī)檢測需求，提供準確的鑒定結果。對部分臨床少見菌株，實驗室須不斷更新儀器的數(shù)據(jù)庫和檢測方法。綜上所述，兩臺儀器在鑒定結果上準確率高，一致性較好，均值得在臨床實驗室推廣使用。