泛酸合成酶菌株篩選及其催化生產(chǎn)D-泛酸的研究

馬玉玉 宋 偉 馮小娜 劉 佳 錢園園

(1. 安徽科技學(xué)院食品工程學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

泛酸(Pantothenic acid，PA)又稱維生素B5，是一種水溶性維生素，僅D-型(D-PA)具有生物活性，是活細(xì)胞中合成輔酶A(CoA)的關(guān)鍵前體物質(zhì)，也是生命必需的維生素[1-2]。泛酸具有制造抗體的功能，在維護(hù)頭發(fā)、皮膚以及血液健康方面有著重要的作用，目前被廣泛應(yīng)用于制藥行業(yè)、食品工業(yè)、化妝品以及飼料添加劑[3-4]。純游離泛酸是一種黃色黏稠的油狀物，酸性，易溶于水和乙醇，不溶于苯及氯仿，在酸、堿以及光熱條件下都不能穩(wěn)定存在[5]。

目前，生產(chǎn)D-泛酸的方法有：① 物理誘導(dǎo)結(jié)晶法，利用混旋泛酸鈣的溶解度大于D-型或L-型這一特點(diǎn)進(jìn)行誘導(dǎo)結(jié)晶，此方法工藝成熟，但只能生產(chǎn)泛酸鈣，無法用于其他泛酸衍生物的生產(chǎn)。② 化學(xué)拆分法，利用氯酶胺等手性拆分劑拆分，但拆分劑價(jià)格昂貴，分離困難，還存在毒性和環(huán)境污染問題[6]。③ 微生物法，包含代謝工程法、發(fā)酵法和生物酶法。Zhang等[7]利用代謝工程法生產(chǎn)D-PA，方法復(fù)雜，產(chǎn)量低，最高產(chǎn)量?jī)H28.45 g/L；發(fā)酵法的產(chǎn)量較高，但存在發(fā)酵產(chǎn)物成分復(fù)雜，不利于下游提取等問題[8-9]，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)食品品質(zhì)也會(huì)產(chǎn)生一定的影響[10-12]；生物酶法是利用泛酸合成酶(PS)催化D-泛解酸和β-丙氨酸進(jìn)行縮合反應(yīng)生成D-PA，反應(yīng)條件溫和，沒有副產(chǎn)物的生成，更有利于產(chǎn)品分離。Miyatake等[13-14]研究了大腸桿菌來源的PS酶的酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)PS酶的最適pH為10.0，最適溫度為30 ℃。Tigu等[15]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌來源的PS酶最適pH為9.0，最適溫度為37 ℃。目前，有關(guān)利用泛酸合成酶合成D-泛酸的研究較少，Miki等[16]篩選了來自E.coli的PS酶經(jīng)過60 h的發(fā)酵得到117.5 g/L的D-PA，其發(fā)酵周期長(zhǎng)，時(shí)空產(chǎn)率較低。由于反應(yīng)需腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)提供能量(見圖1)，所以酶法生產(chǎn)D-PA過程中大多需額外添加ATP，而ATP價(jià)格昂貴，極大地增加了D-泛酸的生產(chǎn)成本。

圖1 生物酶法合成D-PA

試驗(yàn)擬從11種菌株中篩選出泛酸合成酶活性最高的短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)，并將其在大腸桿菌中表達(dá)后進(jìn)行體外催化D-泛解酸和β-丙氨酸生產(chǎn)D-泛酸試驗(yàn)。對(duì)培養(yǎng)基種類、誘導(dǎo)劑種類與濃度、誘導(dǎo)溫度、培養(yǎng)基中的殘?zhí)橇繚舛纫约把a(bǔ)料分批發(fā)酵在5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行邊發(fā)酵邊轉(zhuǎn)化優(yōu)化，利用活菌在生長(zhǎng)過程中的糖酵解反應(yīng)產(chǎn)生的ATP，無需外部添加，能大大降低生產(chǎn)成本。旨在為酶法生產(chǎn)D-PA的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

帚石南棒桿菌(Corynebacteriumcallunae)、黃色考克氏菌(Kocuriaflava)、脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；

短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis168)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、EscherichiacoliJM109、EscherichiacoliBL21 (DE3)、質(zhì)粒pET-28a(+)：實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑與儀器

D-泛解酸鈉(99%)、D-泛酰內(nèi)酯(99%)、β-丙氨酸(98%)：分析純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

氫氧化鈉、鹽酸、氨水、乙腈、甲醇等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI、一步同源重組試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；

ATP檢測(cè)試劑盒、His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；

高效液相色譜儀：Waters 2695型，美國(guó)Waters公司；

發(fā)酵罐：BIOTECH-5JG型，5 L，上海保興生物設(shè)備有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基的配制

(1) LB液體培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L。

(2) LB固體培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，2%體積分?jǐn)?shù)的瓊脂粉。

(3) TB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，甘油4 g/L，磷酸二氫鉀2.31 g/L，磷酸氫二鉀16.42 g/L。

(4) 葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，硫酸銨9 g/L，碳酸鈉2 g/L，磷酸二氫鉀6.8 g/L，磷酸氫二銨4 g/L，七水合硫酸鎂0.8 g/L，一水合檸檬酸0.8 g/L，酵母粉2 g/L，碳酸氫鈉2 g/L，微量金屬溶液5 mL/L。

(5) 微量金屬溶液：七水合硫酸亞鐵10 g/L，二水合氯化鈣2 g/L，七水合硫酸鋅2.2 g/L，一水合硫酸錳0.5 g/L，五水合硫酸銅1 g/L，二水合氧化鉬二鈉0.1 g/L，一水合氧化硼二鈉0.02 g/L，鹽酸5 mol/L。

(6) 補(bǔ)料培養(yǎng)基：葡萄糖650 g/L，磷酸氫二銨8.5 g/L，七水合硫酸鎂8 g/L。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

(1) 平板培養(yǎng)：將保藏的菌種接種至LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

(2) 種子培養(yǎng)：用接種針從平板上挑取菌體，接入LB液體培養(yǎng)基(50 mL/250 mL)中，37 ℃下200 r/min搖床中培養(yǎng)12 h。

(3) 發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)：將種子培養(yǎng)基接種至發(fā)酵培養(yǎng)基(100 mL/500 mL)中，接種量為10%，37 ℃下200 r/min搖床中培養(yǎng)12 h。

(4) 5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)：5 L發(fā)酵罐中初始裝液量為1.3 L，溫度30 ℃，接種量10%，自動(dòng)流加純氨水與4 mol/L鹽酸控制pH值為7.0，攪拌轉(zhuǎn)速550 r/min，通氣量2 vvm，底物投入量500 mL，包含60 g/LD-泛酰內(nèi)酯和40 g/Lβ-丙氨酸。

(5)D-泛解酸鈉的制備：為降低生產(chǎn)成本，使用1 mol/LD-泛酰內(nèi)酯與1 mol/L NaOH在室溫條件下完全反應(yīng)3 h生成1 mol/LD-泛解酸鈉[14]。

1.2.2 細(xì)菌基因組及質(zhì)粒提取 將菌種先在含有LB固體培養(yǎng)基的平板中活化，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取培養(yǎng)好的單菌落至50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，取1.5 mL 菌液離心進(jìn)行基因組提取，具體操作方式參考生工生物工程(上海)股份有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作手冊(cè)。取100 μL含 pET-28a的大腸桿菌菌液至30 mL含有卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，按生工生物工程(上海)股份有限公司質(zhì)粒小提試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行操作。

1.3 PS酶重組載體的構(gòu)建

以上述11種菌的基因組作為模板，分別將11種菌株來源的酶命名為PSCc、PSMl、PSKf、PSBb、 PSBf、PSPa、PSSa、PSBm、PSCg、PSBs、PSEc，設(shè)計(jì)引物序列見表1。PCR擴(kuò)增獲得泛酸合成酶基因，將PCR產(chǎn)物回收。pET-28a(+)載體的質(zhì)粒使用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切。使用一步同源重組的方法將PCR回收產(chǎn)物連接到表達(dá)載體pET-28a(+)中，37 ℃放置30 min，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，用含有卡那抗性的LB平板進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子篩選，將篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子使用T7通用引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證成功的菌落挑出送往蘇州金唯智生物科技有限公司對(duì)目的基因進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.4 PS酶表達(dá)菌株的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pET-28a(+)-PS測(cè)序結(jié)果正確后，將其導(dǎo)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，用含有卡那抗性的LB平板進(jìn)行篩選，選擇轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證成功的轉(zhuǎn)化子挑入含有卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，將其放入甘油管中-40 ℃保藏。

1.5 酶活測(cè)定

混合物包括：100 μL純化后的泛酸合成酶，50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)，25 mmol/LD-泛解酸鈉鹽，25 mmol/Lβ-丙氨酸，4.5 mmol/L ATP，10 mmol/L MgCl2，15 mmol/L KCl，總體積1.1 mL。加入泛酸合成酶開始反應(yīng)，30 ℃培養(yǎng)30 min，隨后添加1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH停止反應(yīng)[15]。

1.6 蛋白純化

結(jié)合液包含10 mmol/L的NH4HPO4、10 mmol/L NaH2PO4、0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L咪唑、1%甘油，pH 7.4。洗脫液包含10 mmol/L的NH4HPO4、10 mmol/L NaH2PO4、0.5 mol/L NaCl、0.5 mol/L咪唑，pH 7.4。將表達(dá)有待純化蛋白的菌株與結(jié)合液按1∶10 (g/mL)充分懸浮，破碎。4 ℃下8 000 r/min離心30 min，收集上清。0.22 μm過膜備用，以20 mg粗蛋白/mL 填料的比例上柱。具體操作步驟參照上海碧云天生物技術(shù)有限公司His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒的操作手冊(cè)。

1.7 蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，取8支干凈的試管，并編號(hào)0～7，參照毛伍祥[17]的方法，于595 nm處測(cè)定其吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白液濃度為橫坐標(biāo)作圖，得蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.001 5x+0.381 5(R2=0.994 8)。

1.8 HPLC測(cè)定條件

流動(dòng)相為95% 50 mmol/L NH4H2PO4緩沖液(用磷酸調(diào)pH至3.0)和5%乙腈，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，柱溫25 ℃，色譜柱為E clipse XDB-C18Column(5 μm，4.6 mm×250 mm)，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.9 細(xì)胞內(nèi)ATP含量測(cè)定

將沉淀細(xì)胞離心，棄上清，輕輕彈散細(xì)胞，按6孔板每孔加入200 μL裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，取上清用于后續(xù)的測(cè)定，具體操作參照上海碧云天生物技術(shù)有限公司ATP檢測(cè)試劑盒的操作說明書。

1.10 數(shù)據(jù)處理

采用Excel對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及誤差分析，采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 PS酶的篩選

由表2可知，PSBb的酶活最高，為1 562.3 U/mL，PSMl的活性稍低，為946.5 U/mL，PSPa與PSSa則無活性，將結(jié)果與文獻(xiàn)[18]的PS酶活進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，PSBb的酶活更高，高出247.5 U/mL。

表2 PS酶活測(cè)定結(jié)果

2.2 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.1 PS酶的分離純化 由圖2可知，PSBb的蛋白大小為32 kD，說明試驗(yàn)所得蛋白是正確的，純化后的蛋白濃度為11 233.3 mg/mL。

M. Low Marker PSBb. 純化后的蛋白質(zhì)

2.2.2 酶學(xué)參數(shù) 由圖3可知，PS酶的活性隨溫度的升高先增加后降低，當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)，酶活性喪失，PS酶的最適反應(yīng)溫度為30 ℃。PS酶在30 ℃下放置12 h后，殘余酶活為87.5%，40 ℃放置12 h后殘余酶活為57.4%，50 ℃放置12 h后殘余酶活為11.5%。當(dāng)pH為7.0時(shí)，PSBb活性最高，在酸性條件或堿性條件下活性極低。PS酶在pH 7.0～7.5時(shí)穩(wěn)定，放置12 h后其殘余酶活仍達(dá)70%左右。PSBb的Kcat為115.4 s-1，酶與D-泛解酸和β-丙氨酸兩個(gè)底物的親和力差異不大，Km分別為1.2，1.1 mmol/L。

由表3可知，PSBb的轉(zhuǎn)換數(shù)低于文獻(xiàn)[11]的，但Kcat/Km值較大，說明PSBb與底物的親和力更大。

圖3 PS酶學(xué)性質(zhì)研究

表3 不同來源PS酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

2.3 發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基 由圖4可知，使用TB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化46 h后D-PA產(chǎn)量為58.8 g/L，轉(zhuǎn)化率為59.7%，時(shí)空產(chǎn)率為30.9 g/(L·d)；轉(zhuǎn)化48 h后D-PA產(chǎn)量為56.4 g/L，轉(zhuǎn)化率為57.3%，時(shí)空產(chǎn)率為28.2 g/(L·d)。使用葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化46 h后D-PA產(chǎn)量為65.1 g/L，轉(zhuǎn)化率為66.1%，時(shí)空產(chǎn)率為34.3 g/(L·d)；轉(zhuǎn)化48 h后D-PA產(chǎn)量為63.1 g/L，轉(zhuǎn)化率為64.1%，時(shí)空產(chǎn)率為31.6 g/(L·d)。轉(zhuǎn)化46 h后D-PA產(chǎn)量最高，故將轉(zhuǎn)化時(shí)長(zhǎng)確定為46 h。葡萄糖在菌體生長(zhǎng)過程中參與細(xì)胞糖酵解產(chǎn)生ATP，為反應(yīng)提供能量，使用葡萄糖培養(yǎng)基得到的D-PA產(chǎn)量比使用TB培養(yǎng)基的產(chǎn)量高6.4%，故選用葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化46 h。

箭頭表示底物投入點(diǎn)

2.3.2 誘導(dǎo)劑 由圖5可知，使用乳糖作為誘導(dǎo)劑的發(fā)酵罐中菌體生長(zhǎng)情況更好，OD600 nm可達(dá)40，而使用IPTG作為誘導(dǎo)劑的發(fā)酵罐菌體OD600 nm僅維持在20左右。使用IPTG作為誘導(dǎo)劑轉(zhuǎn)化46 h后D-PA產(chǎn)量為66.3 g/L，轉(zhuǎn)化率為67.4%，時(shí)空產(chǎn)率為34.9 g/(L·d)；使用乳糖作為誘導(dǎo)劑轉(zhuǎn)化46 h后D-PA產(chǎn)量為24.1 g/L，轉(zhuǎn)化率為24.5%，IPTG作為誘導(dǎo)劑時(shí)，相同條件下產(chǎn)量比乳糖的高42.9%。這是由于乳糖作為誘導(dǎo)劑使用時(shí)并非其本身發(fā)揮作用，而是由其同素異形體異乳糖發(fā)揮作用，一部分乳糖作為碳源供菌體生長(zhǎng)，沒有完全誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，所以IPTG作為誘導(dǎo)劑的效果更好。

圖5 誘導(dǎo)劑優(yōu)化

2.3.3 誘導(dǎo)劑濃度 由圖6可知，D-PA產(chǎn)量隨IPTG濃度的增大而減少，當(dāng)IPTG濃度為0.1 g/L時(shí)，D-PA產(chǎn)量最高，為68.9 g/L，轉(zhuǎn)化率為70.0%，時(shí)空產(chǎn)率為36.3 g/(L·d)。IPTG對(duì)菌體有一定的毒性，高濃度會(huì)殺死細(xì)胞，故選擇0.1 g/L為最適IPTG濃度，其產(chǎn)量比未優(yōu)化時(shí)提高了2.6%。

圖6 IPTG濃度優(yōu)化

2.3.4 誘導(dǎo)溫度 由圖7可知，30 ℃時(shí)的D-PA產(chǎn)量均高于其他溫度，該條件下的最高D-PA產(chǎn)量為74.6 g/L，轉(zhuǎn)化率為75.8%，時(shí)空產(chǎn)率為39.3 g/(L·d)。PS酶的最適溫度為30 ℃，此溫度下的酶活性最高，D-PA產(chǎn)量也最大，比未優(yōu)化時(shí)的產(chǎn)量提高了5.8%，因此選擇30 ℃作為最適誘導(dǎo)溫度。

圖7 誘導(dǎo)溫度優(yōu)化

2.4 補(bǔ)料分批發(fā)酵

2.4.1 培養(yǎng)基中殘?zhí)橇績(jī)?yōu)化 試驗(yàn)表明，PSBb細(xì)胞中ATP含量為1.58×10-5μmol/mg，pET-28a(+)細(xì)胞內(nèi)ATP含量為1.15×10-6μmol/mg，5 L發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明，細(xì)胞生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的ATP能滿足反應(yīng)所需的能量。

圖8 殘?zhí)橇績(jī)?yōu)化

由圖8可知，殘?zhí)橇繛?.1～0.5 g/L時(shí)D-PA產(chǎn)量為86.4 g/L，轉(zhuǎn)化率為87.8%，時(shí)空產(chǎn)率為45.5 g/(L·d)；殘?zhí)橇繛?.6～1.0 g/L時(shí)D-PA產(chǎn)量為80.5 g/L，轉(zhuǎn)化率為81.8%，時(shí)空產(chǎn)率為42.4 g/(L·d)；殘?zhí)橇繛?.1～1.5 g/L時(shí)D-PA產(chǎn)量為75.3 g/L，轉(zhuǎn)化率為76.5%，時(shí)空產(chǎn)率為39.6 g/(L·d)；殘?zhí)橇繛?.6～2.0 g/L時(shí)D-PA產(chǎn)量為68.7 g/L，轉(zhuǎn)化率為69.8%，時(shí)空產(chǎn)率為36.2 g/(L·d)。殘?zhí)橇靠刂坪筠D(zhuǎn)化生產(chǎn)的D-PA產(chǎn)量比未控制時(shí)提高了12%，故殘?zhí)橇靠刂圃?.1～0.5 g/L時(shí)的效果最好。

2.4.2 底物分批投入 由圖9可知，當(dāng)分3批次投入底物時(shí)，反應(yīng)結(jié)束菌體OD600 nm達(dá)28左右，D-PA產(chǎn)量為89.1 g/L，轉(zhuǎn)化率為90.5%，時(shí)空產(chǎn)率為46.9 g/(L·d)；當(dāng)分5批次投入底物時(shí)，反應(yīng)結(jié)束菌體OD600 nm達(dá)35左右，D-PA產(chǎn)量為92.2 g/L，轉(zhuǎn)化率為93.7%，時(shí)空產(chǎn)率為48.5 g/(L·d)；當(dāng)分8批次投入底物時(shí)，反應(yīng)結(jié)束菌體OD600 nm達(dá)67左右，D-PA產(chǎn)量為78.4 g/L，轉(zhuǎn)化率為79.6%，時(shí)空產(chǎn)率為41.3 g/(L·d)。說明高濃度的β-丙氨酸會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用，當(dāng)分批次投入后細(xì)胞生長(zhǎng)好的表達(dá)出的蛋白更多，而分8批次投入底物時(shí)菌體濃度很高，產(chǎn)生的D-PA產(chǎn)量卻降低，是因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)過快就會(huì)很難表達(dá)蛋白。在轉(zhuǎn)化過程中底物分5批次投入時(shí)的產(chǎn)量比一批次投入時(shí)的提高了5.9%，所以底物分5批次投入時(shí)效果最好。

圖9 底物分批投入

2.5 D-PA的HPLC與LC-MS驗(yàn)證

由圖10可知，發(fā)酵液的色譜峰出峰時(shí)間約為19.15 min，與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間相同，初步認(rèn)定試驗(yàn)所得產(chǎn)品為D-PA。

圖10 D-PA的HPLC圖譜

由圖11可知，發(fā)酵液色譜峰出峰時(shí)間約為3.37 min，D-PA分子量為219，在檢測(cè)過程中為負(fù)離子檢測(cè)，失去一個(gè)質(zhì)子，所以顯示的分子量為218，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品一致，由此可證明試驗(yàn)所得產(chǎn)品為D-PA。

圖11 D-PA的LC-MS圖譜

3 結(jié)論

將11種來源的泛酸合成酶基因進(jìn)行克隆，在E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)，經(jīng)酶活測(cè)定篩選出活性最高的短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)來源的泛酸合成酶(PS)，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究；在5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行邊發(fā)酵邊轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化，利用生長(zhǎng)中的重組菌株催化D-泛解酸和β-丙氨酸生產(chǎn)D-泛酸。結(jié)果表明，PS酶的最適溫度為30 ℃，最適pH為7.0，轉(zhuǎn)換數(shù)為115.4 s-1。葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中使用0.1 g/L的IPTG，30 ℃下進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)酵液中殘?zhí)橇繛?.1～0.5 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化效果較好。將底物分成5批次投入反應(yīng)時(shí)，D-PA產(chǎn)量最高為92.2 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到93.7%。后續(xù)需進(jìn)一步縮短反應(yīng)時(shí)間，提高產(chǎn)量以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，邊發(fā)酵邊轉(zhuǎn)化過程中發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速、溶氧、通氣量等需進(jìn)一步優(yōu)化。