基于二氧化錫/碳化硅空心球納米鏈的電化學傳感器檢測食用油中黃曲霉毒素B1

吳民富 李 莎 徐振林 孫遠明

(1. 佛山職業技術學院食品科學系，廣東 佛山 528137；2. 廣東省食品安全檢測與溯源技術應用公共實訓中心，廣東 佛山 528137；3. 華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；4. 廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642)

研究擬利用導電性和生物相容性良好的納米材料構建傳感器，采用直接競爭法對待測物進行分析。在電極基底分別修飾二氧化錫/碳化硅空心球納米鏈(SnO2/SiC NCs)、苯胺納米線和金納米顆粒(GNPs)，抗體探針采用膠體金作為載體，提高檢測靈敏度。該傳感器快速、檢測限低、特異性強、檢測過程操作簡便，可應用于食用油中黃曲霉毒素B1的快速檢測。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

氯金酸：≥99%，美國Sigma-Aldrich公司；

黃曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFM1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、伏馬毒素B1(FB1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)：≥96%，北京百靈威科技有限公司；

苯胺、殼聚糖：分析純，上海阿拉丁試劑有限公司；

黃曲霉毒素B1抗體：山東綠都生物科技有限公司；

黃曲霉毒素B1酶聯免疫檢測(ELISA)試劑盒：深圳芬德生物技術有限公司；

漸漸地，偉翔變得很沉默了。沒有什么朋友，也很少出去應酬，下班回來，除了做家務，跟糖果玩，就是把自己關在書房里。陰沉個臉，像誰欠他八百吊。我更加生氣，我累死累活，他倒給我臉色看。

電化學工作站：CHI660D型，上海辰華儀器有限公司；

透射電子顯微鏡：TECNAI12型，荷蘭FEI電子光學有限公司；

掃描電子顯微鏡：Ultra 55型, 德國卡爾蔡司公司；

紫外可見分光光度計：UV1800型，島津企業管理(中國)有限公司。

1.2 二氧化錫/碳化硅空心球納米鏈(SnO2/SiC NCs)的合成

首先合成SnO2@C納米鏈：0.142 g錫酸鈉和2.73 gD-葡萄糖溶于17.5 mL去離子水，轉移到聚四氟乙烯反應釜，180 ℃恒溫加熱4 h，產物離心后用去離子水和乙醇沖洗，烘干。氬氣保護下置于管式爐中700 ℃ 2 h。合成的SnO2@C納米鏈作為前驅體，加入過量硅粉充分混勻。然后置于管式爐中央，在氬氣環境中以3 ℃/min的速率加熱到1 320 ℃，保持4 h。產物用硝酸∶氫氟酸3∶1溶液處理12 h，除去過量的硅，100 ℃烘干備用[18]。

1.3 金納米顆粒(GNPs)的制備

采用檸檬酸三鈉還原法。100 mL 0.01%的四氯金酸水溶液置于圓底燒瓶，電熱套加熱至沸騰。持續攪拌下迅速加入2 mL 1%的檸檬酸三鈉水溶液，繼續攪拌加熱3 min，直至溶液呈現透亮的紅色。室溫下冷卻，4 ℃下保存備用。

1.4 辣根過氧化物酶—金納米顆粒—抗體(HRP-GNPs-Ab)的制備

取上述制備的GNPs 500 μL，用0.1 mol/L的碳酸鉀溶液將pH調至9.6。加入1 mL 20 μg/mL的黃曲霉毒素B1抗體和1 mL 0.5 mg/mL的HRP，旋渦混勻30 min后用1 mL 5%的BSA溶液封閉1 h，12 000 r/min 4 ℃離心30 min，沉淀用1 mL 0.01 mol/L pH 7.4的PBS反復洗滌。產物分散于1 mL 0.01 mol/L pH 7.4 的PBS中，4 ℃保存備用。

1.5 修飾電極的制備與檢測

直徑為3 mm的玻碳電極(GCE)先后在含1.00，0.30，0.05 μm Al2O3粉末的麂皮上拋光至鏡面，用50%的HNO3水溶液、無水乙醇和去離子水分別超聲清洗電極表面，氮氣吹干備用。取1 mg SnO2/SiC NCs超聲分散在1 mL去離子水中，取200 μL分散好的SnO2/SiC NCs加入100 μL 0.1% 的殼聚糖(CS)醋酸溶液，斡旋震蕩混勻。取5 μL SnO2/SiC NCs/CS滴加到預處理好的玻碳電極表面，37 ℃烘箱中烘干。上述電極置于6 mL含0.5 mmol苯胺的H2SO4溶液(0.5 mol/L)中，采用三電極系統(玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對電極)在0.0～1.0 V的電位區間循環伏安法(CV)掃描16段，使電極表面生成聚苯胺納米線(PANINW)。去離子水沖洗電極表面，氮氣吹干。上述電極置于經N2除氧10 min的含2 mmol/L氯金酸的H2SO4溶液(0.5 mol/L)中，采用三電極系統在-0.1～0.2 V的電位區間CV掃描12段，去離子水沖洗電極表面，氮氣吹干。上述電極滴加5 μL一定濃度的包被原，37 ℃孵育3 h。未吸附的包被原用0.01 mol/L pH 7.4的PBST沖洗，氮氣吹干后用8 μL 10%的BSA溶液孵育1.5 h封閉未結合位點，防止非特異性吸附。用0.01 mol/L pH 7.4的PBST沖洗電極，置于4 ℃冰箱中備用。

1.6 電化學檢測

2.5 μL不同濃度的AFB1和2.5 μL HRP-GNPs-Ab探針先后滴加到上述修飾電極，37 ℃孵育1 h后用PBST沖洗。修飾電極與鉑電極、飽和甘汞電極組成三電極體系，置于6 mL 1 mmol/L的對苯二酚緩沖液，在-0.6～0.8 V范圍進行循環伏安法(CV)掃描。電化學工作站記錄加入25 μL 0.48 mol/L H2O2前后的CV曲線。

1.7 樣品處理

2 g待測食用油置于15 mL離心管，加入2 mL正己烷和4 mL甲醇。漩渦震蕩提取5 min，6 000 r/min離心5 min，取1 mL下層甲醇溶液加4 mL去離子水混勻待測。

2 結果與討論

2.1 檢測原理

所制備的直接競爭免疫傳感器檢測原理如圖1所示，首先在玻碳電極表面修飾具有良好導電性和生物相容性的殼聚糖、SnO2/SiC NCs、聚苯胺納米線(PANINW)和金納米顆粒(GNPs)，利用Au—S鍵固定包被原，卵清蛋白(OVA)封閉未結合位點。同時加入HRP-GNPs-Ab和待測物，采用競爭反應模式，電極上的納米金標記探針HRP-GNPs-Ab的固定量與待測物濃度呈反比，納米金標記探針上的HRP酶催化對苯二酚(HQ)和過氧化氫產生電化學信號，通過電化學工作站記錄。根據電化學信號與待測物濃度的關系建立檢測的標準曲線。

圖1 免疫傳感器的檢測原理

碳化硅(SiC)、二氧化錫(SnO2)和聚苯胺等納米材料各具優點，在傳感器中具有良好的應用前景。SiC納米材料具有加速電子和質子傳遞的作用，并且具有良好的穩定性[19-20]；二氧化錫納米材料具有比表面積大、易于功能化和良好的電子傳導性能[21]，SnO2/SiC NCs作為新型納米復合材料，兼具SnO2和SiC的優點，目前未有SnO2/SiC NCs納米復合物在黃曲霉毒素檢測中應用的報道。聚苯胺具有良好的生物相容性和導電性，是生物分子的良好受體[22]。通過納米材料的應用，可提高生物分子的固載，加快電極表面的電子傳遞速率，提升檢測靈敏度。

2.2 二氧化錫/碳化硅空心球納米鏈的表征

采用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡對所制備的SnO2/SiC空心球納米鏈(SnO2/SiC NCs)進行表征，由圖2可知，SnO2/SiC NCs呈均一的空心簇狀球形結構，直徑約為80 nm，呈現出立體結構。SnO2/SiC NCs的三維結構使得電極的有效面積大大增加，粗糙的表面有利于苯胺的沉積，更好地固定包被原。

圖2 SnO2/SiC空心球納米鏈的掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡

2.3 HRP-GNPs-Ab的表征

HRP-GNPs-Ab復合物的紫外—可見光譜如圖3所示，HRP酶在405 nm處有吸收峰，抗體在280 nm處有吸收峰，金納米顆粒在514 nm處有強吸收峰，所制備的HRP-GNPs-Ab吸收峰分別在275，405，536 nm，表明HRP和抗體成功地偶聯在金納米顆粒上[23]。

圖3 HRP、Ab、GNPs和HRP-GNPs-Ab的紫外—可見光譜圖

2.4 電極組裝過程的表征

a. GCE b. SnO2-SiC NCs/CS/GCE c. PANINW/SnO2-SiC NCs/CS/GCE d. GNPs/PANINW/SnO2-SiC NCs/CS/GCE e. Antigen/GNPs/PANINW/SnO2-SiC NCs/CS/GCE

2.5 納米傳感器的信號放大

傳感器通過待測物濃度與電化學信號的關系建立標準曲線。二者在一定的條件下呈正相關關系[25]。因此，通過增加反應轉移的電子數及增大電極表面的有效面積，可增加響應電流，提高檢測的靈敏度。

試驗采用納米材料在基底和探針雙重放大信號策略進行信號放大。通過金標記抗體探針上的HRP酶催化過氧化氫產生信號，以對苯二酚(HQ)作為電子轉移中介體，研究傳感器在HQ溶液中的電化學行為。GNPs/PANINW/SnO2-SiC NCs/CS作為基底修飾材料，多層納米材料具有優良的生物相容性、導電性及大比表面積，作為基底材料可以更好地固定生物分子，提高電流響應速度。GNPs用于標記探針有利于增加單位抗體上HRP酶的固載量，放大電流信號，提高檢測靈敏度。為驗證納米材料對傳感器信號的提升作用，對比不同基底修飾和探針對信號的影響，研究不同修飾的電極在含1 mmol/L HQ 的pH 7.4 PBS中的電化學行為。采用直接沉積金和單標記抗體時，電流變化值為14.8 μA[圖5(a)]；先后加入SnO2-SiC NCs和聚苯胺納米線后，電流變化值分別增大至21.6 μA[圖5(b)]和24.1 μA[圖5(c)]；采用HRP-GNPs-Ab探針后，電流變化值增大為32.9 μA[圖5(d)]，說明納米材料放大了電化學信號，有利于提高反應的靈敏度。

虛線為未添加過氧化氫的循環伏安曲線，實線為添加25 μL過氧化氫后的循環伏安曲線

2.6 反應條件優化

試驗對包被原和抗體濃度、pH、反應時間等條件進行優化，結果見圖6。包被原過高可能會形成空間位阻，阻礙抗原抗體的結合，過低則會降低電化學信號[26]。1 mg/mL的包被原從200倍開始稀釋，稀釋1 600倍時達到最大峰電流差[圖6(a)]。抗體濃度直接影響檢測的靈敏度，所制備的金標記抗體探針稀釋40倍時電流變化值最大[圖6(b)]。pH值一方面影響抗原—抗體反應的親和性和抗原和抗體的活性，過高或過低的pH會導致蛋白質的變性；另一方面影響藥物的溶解度，從而影響其與抗原抗體的相互作用。當反應的緩沖溶液pH為7.5時，電化學信號變化值最大[圖6(c)]。抗原—抗體反應是可逆反應過程，其反應達到平衡需要一定的時間。反應的孵育時間關系到抗原抗體的結合程度。當孵育時間達到30 min后，電化學信號變化基本達到平衡[圖6(d)]，因此選取30 min作為反應的孵育時間。

圖6 包被原和HRP-GNPs-Ab的稀釋倍數、pH、孵育時間對免疫傳感器性能的影響

2.7 傳感器的電流響應

所制備的納米電化學傳感器基于直接競爭免疫反應原理對AFB1進行檢測。在最優條件下，不同濃度AFB1引起的電化學響應如圖7(a)所示。隨著AFB1濃度的降低，還原峰電流增加。以AFB1濃度的對數值為橫坐標，以體系加入過氧化氫前后電流變化值為縱坐標作圖，采用Origin軟件進行線性擬合得到校準曲線[圖7(b)]：y=(22.36±0.13)-(4.78±0.07) lgx，R2=0.999 0，線性范圍為3.81 pg/mL～1.00 μg/mL，檢出限為1.13 pg/mL (S/N=3)。

圖7 免疫傳感器對AFB1檢測的CV響應曲線和校準曲線

所構建的免疫傳感器與近兩年文獻報道的AFB1檢測方法相比，具有更寬的線性范圍及更低的檢測限，表明該傳感器具有一定的技術優勢(見表1)。

表1 AFB1檢測方法比較

2.8 傳感器的重現性、穩定性和特異性

穩定性、重現性和特異性是衡量傳感器能否在實際檢測中應用的重要指標。為評估免疫傳感器的重現性，制備的傳感器對5個不同濃度的AFB1進行檢測。每個樣品均做3個重復，相對標準偏差在1.47%～3.54%，表明傳感器具有良好的重現性。通過定期測量4 ℃保存的傳感器隨時間的變化，評估其穩定性。結果表明，傳感器在14 d后的電流響應為第1天的81.7%～85.5%，表明修飾的電極具有較高的穩定性。對所構建的AFB1傳感器的特異性進行評估，在相同的條件下分別檢測AFB1及其結構類似物在1 μg/mL濃度所引起的電流變化值(圖8)。結構類似物引起的電流響應變化值為AFB1的0.60%～6.21%，表明該傳感器具有良好的特異性。

圖8 免疫傳感器對AFB1及其結構類似物的電流響應變化值

2.9 實際樣品檢測

所構建的傳感器用于實際樣品檢測，將其檢測結果與ELISA試劑盒進行比對(表2)。結果表明，傳感器對樣品的檢測與ELISA法一致。檢測回收率在84.6%～107.6%，變異系數(CV)在5.42%～10.49%，說明所構建的傳感器可應用于實際樣品的檢測。

表2 實際樣品添加回收率

3 結論

研究成功構建基于納米材料的AFB1電化學傳感器。試驗結果表明，該傳感器對黃曲霉毒素B1的檢測線性范圍在3.81 pg/mL～1.00 μg/mL，檢出限為1.13 pg/mL，對實際樣品的檢測添加回收率在84.6%～107.6%，與ELISA檢測結果基本相符。所構建的傳感器與文獻(表1)報道的AFB1檢測方法相比，具有較寬的線性范圍和較低的檢測限。該傳感器快速、靈敏，操作簡便，特異性強，準確性高，可應用于實際樣品的檢測。