嗜鹽微生物對發酵海鮮調味品風味影響研究進展

于 靖 楊錫洪,2 梁 晨 郁東興 解萬翠,2,

(1. 青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東 青島 266042；2. 山東省生物化學工程重點實驗室，山東 青島 266042；3. 青島智科檢驗檢測有限公司，山東 青島 266002；4. 尚好科技有限公司，山東 青島 266002)

傳統發酵型海鮮調味品如魚露、蝦醬等是由低值魚蝦蟹貝藻等經由鹽漬、發酵等工藝加工制成[1]，味道鮮美，呈味成分豐富多樣，富含多種呈味氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和天門冬氨酸等，以及多肽、低聚糖和?；撬岬榷喾N保健性成分[2]，具有很大的發展前景及開發價值。但傳統發酵過程中過高的鹽度和自然溫度導致發酵周期長、產量低、成本高、不利于規?；a等弊端，因此，一些現代速釀技術如低鹽保溫工藝、外加酶法與外加曲法等成為近年來研究的重點方向。雖然速釀技術能顯著縮短發酵進程，減少產物的含鹽量和腥臭味，但快速發酵的產品風味難以與傳統工藝媲美。因此，在縮短發酵周期的基礎上盡可能模擬傳統產品風味，是當前海鮮調味品速釀技術研究的熱點問題。

傳統發酵海鮮調味料的風味主要來源于微生物的發酵，通過微生物間的作用使最初的原料轉化為發酵過程中的蛋白質、脂肪等物質，在一系列復雜化學反應中豐富產品風味。隨著從各類海鮮調味品中分離出越來越多的微生物，研究者們發現海鮮調味品的速釀技術可以通過一些性能優良的嗜鹽菌株進行改良。Saithong等[3]在自然發酵的魚制品中分離到2種乳酸菌，能夠顯著縮短發酵周期，Yossan等[4]研究發現，在發酵魚醬油中篩選出的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，能夠產生堿性蛋白酶，促進風味物質前體氨基酸的轉化，從而豐富產品醇香鮮美的口感?？梢?，嗜鹽微生物分泌的蛋白酶、肽酶、堿性磷酸酶等不僅能夠促進原料底物進行分解及生物轉化，顯著縮短發酵周期，還能將肽和寡肽轉化為前體氨基酸從而形成海鮮調味品特有的風味物質，有利于海鮮調味品鮮美醇香氣味的形成。文章擬介紹嗜鹽微生物在海鮮調味快速發酵及風味形成中的應用，從氨基酸代謝和基因調控層面闡明嗜鹽菌對速釀產品風味影響機理，以期為海鮮調味品現代化加工技術提供新的指導思路。

1 傳統海鮮調味品的發酵風味特征

常見的海鮮調味品包括魚醬、蝦醬、蟹醬、魚露、蝦油、蠔油等，以海洋資源為原料，利用自身的酶或微生物通過一定的周期自然發酵而成。海鮮調味品發酵過程中，微生物能夠利用其產生的胞內及胞外酶類加速原料底物的分解和生物轉化，同時產生多肽、呈味氨基酸等多種利于良好風味形成的成分，以及各種揮發性和非揮發性風味物質共同組成的復雜化合物體系。

1.1 感官特征及特征性風味化合物

水產調味品品質的重要決定因素是其風味，明確風味物質的組成對調控與保持產品風味十分必要。在海鮮調味品發酵過程中，微生物與酶之間會在原料組分中相互作用，通過小分子物質的形成進而左右成品的風味，因此發酵工藝與產地不同而引起的揮發性物質組成差異使其形成了各自的風味特征。

醇類是海鮮調味品中主要揮發性物質之一，主要由多不飽和脂肪酸經脂肪酸氧化酶作用衍生而來[5]，是海鮮調味品植物香、肉香味和溫和油脂味的主要來源[6]。趙洪雷等[7]在探究不同產地蝦醬風味差異時發現，作為亞油酸降解產物的1-辛烯-3-醇，呈現草香味和蘑菇香氣，苯乙醇呈蜂蜜香和微略的玫瑰香。由不飽和脂肪酸氧化產生的醛類物質，閾值較低，因此在發酵水產調味品風味特征中發揮重要作用[8]，主要產生油燒味，但其中苯甲醛和苯乙醛具有堅果香、水果香和令人愉悅的風信子香等獨特香氣[9]，3-甲硫基丙醛具有肉香和馬鈴薯香。酮類的香氣閾值遠高于其同分異構體的醛類物質，由于其具有獨特的花香和果香味，對海鮮調味品風味有一定增強作用[10]。李瑩等[11]在分析傳統錦州白蝦蝦醬揮發性物質時發現，2-壬酮呈有焦糖香和脂肪味，3-辛酮呈有水果香和略微的薰衣草氣味，香葉基丙酮呈現蠟味、木香味和果香味。含硫類化合物能夠賦予產品堅果香、果蔬香、烘烤香和肉類香氣，二甲基二硫與二甲基三硫主要具有洋蔥香等蔬菜香氣，是海鮮發酵調味料的特征風味物質。由脂肪氧化產物參與美拉德反應得到的吡嗪類物質，主要呈現堅果香和烘烤香味，Hou等[12]發現，吡嗪類既是醬類產品的特征性風味物質，也是鮮蝦肉中主要的風味物質，可以賦予蝦醬產品濃厚的醬香味和鮮味。

傳統海鮮調味品開放式的自然發酵難以準確控制產品品質和風味，這是影響產品質量穩定的主要障礙，而現代發酵工藝得到的產品又往往存在風味不足的缺陷。因此，為實現產品質量和風味的穩定控制，海鮮調味品的速釀工藝還需要與微生物的發酵作用結合。

1.2 嗜鹽微生物對海鮮調味品特征風味的影響

由傳統海鮮調味品中分離的微生物，主要是一些嗜溫及嗜鹽的細菌，在發酵過程中對原料的分解和風味物質的形成發揮著關鍵作用。如表1所示，它們所產生的蛋白酶、肽酶和堿性磷酸酶等能夠與原料自身所產酶類協同作用，加快原料底物分解，充分利用原料中的蛋白質、脂肪等物質，促進海鮮調味品中重要營養和風味物質的形成[22]。

表1 不同海鮮調味品中嗜鹽微生物及其所產的酶

海鮮調味品中的嗜鹽菌所分泌的胞內及胞外酶類不僅能夠適應發酵過程中高溫高鹽特點，還能夠與原料自身內源酶和微生物協同作用加快原料底物分解，大大縮短發酵周期[23]。Sinsuwan等[24]研究發現，存在于魚醬油中的嗜鹽枝芽孢桿菌(Virgibacillussp.) SK37，在高鹽溶液中產生的胞外蛋白酶仍有水解活性。Akolkar等[25]探究了鹽桿菌(Halobacteriumsp.) SP1在加速魚醬油發酵進程中的作用，最終發現微生物菌群間之間產生了累加效應，含有鹽桿菌的SP1(1)樣品組在發酵中期，蛋白酶活性和α-氨基含量均較高，可見，鹽桿菌SP1能夠作為理想發酵劑縮短魚醬油的發酵周期。

嗜鹽微生物能夠充分利用原料中的蛋白質、脂肪等物質，將其降解為形成風味前體物質的寡肽、低聚肽及脂肪酸等，促進海鮮調味品特征風味中低分子揮發性酸和呈味氨基酸等重要營養和風味物質的形成[26]，構成海鮮調味品獨特的口感和風味。Beddows等[27]在研究細菌對發酵魚醬油風味影響時發現，魚醬油中的氨基酸經由細菌的代謝作用能夠衍生形成多種呈味氨基酸如丙酸、丁酸等，使產品形成獨特的奶酪香氣。Udomsil等[28]發現嗜鹽微生物分泌的內源酶活性對發酵型海鮮調味品的風味形成有重要作用，從魚醬油中篩選到的嗜鹽四聯球菌MRC5-5-2和MS33，因其胞內氨基肽酶活性較高，可以產生促進產品肉味和杏仁味形成的苯甲醛和2-甲基丙醇。Udomsil等[29]在進行魚醬油速釀發酵時，將篩選到的葡萄球菌(S.piscifermentans) CMC5-3-1作為功能性發酵劑，結果表明試驗組中能夠產生更多具有黑巧克力香氣的2-甲基丙醛。

通過嗜鹽微生物的代謝作用和生物轉化還能夠有效減少海鮮調味品發酵過程中不良風味的產生。向軍等[30]發現，產氨基肽酶的甲基營養型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)能夠將苦味肽氨基端的疏水氨基酸切除，有利于減輕發酵產品中的苦味。段旭昌等[31]研究發現乳酸菌發酵可以使苦味氨基酸轉化，改善甲魚酶解液的整體風味，其中呈苦味的Asp、Cys、Val、Ile、Lys和Arg含量在發酵后期明顯減少，而呈微苦味的Phe和甜味的Ala含量略微增加。Fukami等[32]研究發現，在魚醬油發酵進程中添加木葡萄球菌能夠減少產品中的魚腥臭味和腐敗酸味，顯著提升產品風味品質。利用嗜鹽微生物代謝作用提高海鮮調味品中特征風味物質的含量，有利于改良速釀工藝中產品風味不足的缺陷。

2 傳統發酵海鮮調味品嗜鹽菌代謝及風味形成機制

微生物代謝作為海鮮調味品揮發性風味物質形成的主要途徑，是指導傳統海鮮調味品速釀發酵技術并提升風味品質的突破點。其中不同種類的嗜鹽微生物其代謝通路和基因特征不同，在海鮮調味品的原料分解和風味形成過程中均發揮積極貢獻。

2.1 氨基酸代謝模式及途徑

蛋白質分解釋放出足夠的氨基酸對海鮮調味品形成完整的風味是必不可少的，蛋氨酸和半胱氨酸等氨基酸是發酵食品中風味物質的主要來源[33]。研究[34]發現，亮氨酸是具有調節蛋白質代謝作用的主要支鏈氨基酸，由亮氨酸通過酮酸和醛轉化為乙醇的途徑為Ehrlich途徑。支鏈醛類物質是發酵食品中的重要風味化合物，其中3-甲基丁醛和2-甲基丁醛是醬油中最重要的氣味劑之一，具有麥芽樣或巧克力樣的強烈香氣，主要由微生物的Ehrlich途徑和支鏈氨基酸的生物合成途徑產生[35]。如圖1所示，3-甲基丁醛是亮氨酸分解代謝的中間體，亮氨酸與酮酸之間的氨基轉移由亮氨酸氨基轉移酶催化，通過對應的α-酮酸進一步被羥基異氰酸脫氫酶(PanE)降解為羥基酸，被α-酮酸脫羧酶(KivD)分解成醛、醇和酸等風味相關物質[36]。在支鏈氨基酸代謝途徑中，α-酮酸是關鍵節點物質[37]，因此，提高氨基酸濃度和轉氨酶活性能有效地增加α-酮酸含量，促進海鮮調味品發酵過程中特殊風味物質的形成。

圖1 亮氨酸代謝產揮發性風味物質

由于多數細菌轉氨酶活性較低，很難通過添加外源支鏈氨基酸來提高α-酮酸的生成量，進而抑制了揮發性風味物質含量的增加。而野生嗜鹽菌株通常生活在氨基酸含量低的環境中，它們依賴于自身氨基酸的生物合成，因此具有更多的氨基酸轉化酶，為食品原料中蛋白質的降解提供了良好途徑。Udomsil[38]從發酵魚醬油中篩選到7株乳酸菌，均具有較高的胞內氨基轉化酶活性，促進了亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、和谷氨酸等呈味底物的分解轉化，進而豐富魚醬油產品的特征風味。將嗜鹽微生物用于海鮮調味品發酵進程，不僅能夠增加各種呈味氨基酸的含量，還能提高由氨基酸衍生出的風味化合物水平。

2.2 基于基因組學的代謝調控

編碼氨基酸轉化酶的基因受到許多特定機制的調控，包括對酶及其合成的生物化學控制，以及在轉錄水平上運作的調節因子[39]。其中轉氨酶基因(araT、bcaT、kivD、ytjE、panE)等的表達受全局調控因子CodY調控[40]。CodY在氨基酸降解、寡肽轉運、胞外蛋白酶和支鏈氨基酸的生物合成等氮代謝方面具有重要的調控作用，能夠通過改變轉錄速率調控靶基因的表達水平[41]。CodY基因的表達與胞內纈氨酸、異亮氨酸等支鏈氨基酸的水平有關，轉氨酶基因表達水平在纈氨酸、異亮氨酸饑餓脅迫情況下能增強數倍。亮氨酸代謝產物3-甲基丁醛在異亮氨酸饑餓脅迫條件下的生成量比非饑餓培養條件增高了2倍。Yvon等[42]經研究發現亮氨酸、芳香族氨基酸和蛋氨酸轉氨酶具有重疊的底物特性，將乳酸球菌屬中的支鏈氨基轉移酶敲除會導致亮氨酸轉氨作用大大減少。此外，環境因素也能影響氨基酸代謝情況, 例如在酸脅迫條件下，作為乳酸菌代謝產物的支鏈醛含量有所增加。

嗜鹽菌不僅能通過改變碳、氮代謝來應對高酸、高鹽等脅迫環境，還可以通過CodY調控自然感受相關基因，使菌體對外源DNA的攝入量得以提高，從而獲取有助于應對脅迫環境的基因，增強菌株的生長能力。通過研究CodY調控對細菌的碳、氮代謝和自然感受態相關基因的影響，能夠獲得基因優化改良的嗜鹽菌株，用于海鮮調味品的發酵生產工業。

Satomi等[43]在研究魚醬油風味時發現，嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcushalophilus)的質粒上含有hdcA基因，可以通過編碼組氨酸脫羧酶將組氨酸轉化為組胺，進而調節產品風味。Higuchi等[44]發現含有天冬氨酸脫羧酶的嗜鹽菌可通過其質粒上的aspD編碼的脫羧作用，將天冬氨酸轉化為丙氨酸，使酸性氨基酸的含量減少，甜味氨基酸的含量增加，從而使口感變得溫和。Wakinaka等[45]用含溴甲酚紫的天冬氨酸指示劑從發酵魚類食品中分離出嗜鹽四球菌(Tetragenococcushalophilus)，并證實其攜帶天冬氨酸脫羧酶基因(aspD)，將此菌株作為魚露發酵劑可以實現天冬氨酸向丙氨酸的轉化，從而得到口感更加柔和的魚露產品，同時阻止了生物胺在魚露產品中的積累。因此，通過選定或敲除嗜鹽微生物上的特定基因，可以調控氨基酸代謝產物，在減少生物胺積累的前提下提升海鮮調味品風味品質，為在發酵食品工業中利用基因工程改造技術獲得適當菌株奠定了基礎。

3 嗜鹽微生物對生物胺等的影響

生物胺是存在于魚醬油、蝦醬等發酵產品中的堿性含氮化合物，能與亞硝酸鹽反應生成亞硝胺等致癌物質[46]，過多的攝入可能導致人體中毒。部分嗜鹽菌含有內源氨基氧化酶，能夠通過氧化脫氨基作用將生物胺降解同時產生醛類和氨類等風味物質，從而降低海鮮調味產品中生物胺的含量，提升產品的營養和保健功效。

姜維[47]從傳統發酵的魚醬油中分離到了汕頭鹽單胞菌(Halomonasshantousisnov.)，研究發現此菌株能在自身不積累生物胺的前提下將生物胺高效降解，將其作為功能發酵劑用于魚醬油的發酵，能顯著降低產品中腐胺、組胺、尸胺和酪胺含量。Zaman等[48]從魚醬油中分離到了解淀粉芽孢桿菌FS05和肉葡萄球菌FS19，發現這兩種菌株均具有氨基氧化酶活性，能夠顯著降低魚醬油發酵后期的組胺含量。

海鮮調味品中的嗜鹽菌作為功能性發酵劑能夠顯著減少發酵過程中生物胺的積累，提高產品品質功效，有利于適應和促進中國食品工業的發展。

4 結束語

微生物發酵法的應用是海鮮調味品健康生產的重要發展趨勢，應用嗜鹽微生物中氨基酸轉化酶調節原料底物的分解代謝，以及利用基因改造的嗜鹽菌株調控代謝產物，能夠在顯著縮短發酵周期的同時有效模擬發酵產品的傳統風味。繼續探究嗜鹽菌的具體代謝機制以及外源氨基酸對產品品質及特征風味影響從而改進生產工藝，有望在保持海鮮調味品傳統風味的基礎上，實現加工生產效率和產品品質的不斷提升。