Prohibitin表達及對乳腺癌細胞系MCF-7抑制生長的機制研究

周曉艷，李 越，何 謙，袁曉紅，張海寶

（1. 西安交通大學第二附屬醫院檢驗科，西安 710004； 2.西安交通大學環境與疾病相關基因教育部重點實驗室，西安 710061）

抗增殖蛋白（Prohibitin，phb/PHB)，是一種高度保守的蛋白質，因具有增殖抑制作用而得名，分PHB1 和PHB2 兩個亞型[1]。在自然界中分布廣泛，參與人類腫瘤的增殖、轉錄、分化、凋亡及能量代謝等過程，與細胞衰老、免疫調節、代謝性及炎癥性疾病亦緊密聯系。在細胞內作為重要的分子伴侶參與線粒體結構和功能的完整性[2]。近年來乳腺癌發病率及死亡率逐年升高，而 PHB 在乳腺癌組織中表達升高[3]，提示可能成為乳腺癌早期篩查新的生物標志物，可作為乳腺癌診療的重要靶點[4,5]。本課題組在前期蛋白質組學的研究中發現，核基質蛋白PHB 在正常乳腺組織、乳腺增生性病變組織、不典型上皮增生組織和乳腺癌組織4 個乳腺癌不同階段表達逐漸升高[6]，并鑒定了PHB 干擾在乳腺癌MCF-7 中低表達的效果[7]。此次研究驗證了PHB 的高表達，以及PHB 在乳腺癌細胞MCF-7 的生物學功能及生長抑制機制，為乳腺癌的臨床診斷、治療和藥物研發提供新靶標和新的研究線索。

1 材料與試劑

1.1 細胞株來源 人乳腺癌MCF-7 細胞保留了多個分化了的乳腺上皮特性，該研究中MCF-7 受贈與西安交通大學第一附屬醫院婦產科實驗室。

1.2 主要試劑 胎牛血清和DMEM 高糖培養基購于HyClone 公 司，LipofectamineTM2000 為Invitrogen 公司產品，擴增試劑為青島Takara 公司產品，Anti-prohibitin 抗體（ab47778）和兔抗人β-actin（ab6276）均為英國Abcam 公司購買，周期及凋亡試劑盒購于武漢凱基生物有限公司，BALB/C 裸鼠來自西安交通大學實驗動物中心 。

1.3 實驗方法

1.3.1 pEGFP-PHB 基因表達質粒構建：在NCBI 中查閱PHB 的基因序列，以NM_002634 為模板，根據全基因序列，設計29 條引物依次進行擴增，使其序列不斷延長，直至完成所需序列。擴增后電泳，回收837kb 左右條帶進行基因測序。使用Bgl Ⅱ/BamH I 內切酶回收所需的載體骨架pEGFP-C1。將PCR 擴增得到的全長基因和載體在同源重組酶下重組。選用標準大腸菌株ATCC 25922 為轉化菌株，轉化并挑取單克隆進行基因測序。

1.3.2 細胞培養及真核細胞轉染：用質量分數為10ml/dl 胎牛血清的DMEM（高糖）培養液于37℃，體積分數為5ml/dl CO2細胞培養箱培養，2天換液一次，3 天傳代一次。轉染時DNA 與轉染試劑Lipofectamine2000 最佳比例為1∶3。轉染重組質粒pEGFP-PHB 組為PHB 高表達組，即OE 組（轉染重組質粒pEGFP-PHB），轉染空質粒組為陰性對照組，即NC 組（轉染載體pEGFP），只添加Lipofectamine2000 轉染試劑定位空白對照組，即MOCK 組（只添加轉染試劑）。轉染于6, 12, 24, 48 和72h 細胞的生長狀態及熒光表達情況。

1.3.3 real Time PCR 檢測PHB 基因表達：使用Trizol試劑提取總RNA，每組細胞重復3 次，分別提取總RNA，使用Nanodrop2000 核酸蛋白分析儀檢測RNA濃度并做RNA 變性實驗。使用Primer 3.0 軟件設計引物（PHB: Primer1: 5'-GGCTGAGCAACAGAAAAAGG-3'， Primer2: 3'-TTGTAGTGGATGGACGGTCG -5'; GAPDH：Primer1:5'- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3', Primer2: 3' -AGGTGACCGCAGAAGTGGT-5'。），按照 Takara 公司基因擴增說明書進行real-time PCR 反應。擴增條件：95℃反應5s，55℃反應30s，總共40 個循環。以Ct值表示實時定量PCR 擴增的結果，即基因擴增產物的熒光值達到設定閾值所經過的循環數。計算出每組△Ct（CtTarget-CtGAPDH）。Folds=2-△△Ct，其中△△Ct=(Ctl處理樣品待測基因-(Ct1處理樣品待測基因-Ct2處理樣品內參基因)-(Ct3對照樣品侍測基因-Ct4對照樣品內參基因)， 2-△△Ct即為實驗組基因mRNA 相對于對照組的表達倍數。

1.3.4 Western Blotting 檢測PHB 蛋白的表達：使用RIPA 細胞裂解液100μl 裂解細胞，按照SDSPAGE 試劑盒說明書配置分離膠和濃縮膠，每組設置兩個復孔，上層濃縮膠80V 跑30min，下層分離膠120V 跑1h。用PVDF 轉膜，并于質量分數為5ml/dl 的牛奶封閉液中封閉2h，依次孵育一抗(1∶5 000稀釋，4℃過夜)和相應二抗（1∶1 000稀釋）。在UVP 凝膠成像系統進行顯色，Quantity one 軟件計算灰度值。

1.3.5 MTT 生長曲線測定：設PHB 高表達組、陰性對照組及空白對照3 組，每組3 個復孔。轉染4h后更換成完全培養液，分別于轉染后24, 48 和72 h，每孔加入MTT 液20μl，繼續孵育4 h 后終止培養，棄去孔內上清液，再加入100 μl DMSO，震蕩 5～10min。以空白培養液組調零，在酶標儀上測490 nm 波長處各孔的光密度值。細胞生長抑制率的計算公式如下：細胞生長抑制率=1-實驗組A490nm值/對照組A490nm值。

1.3.6 Transwell 小室侵襲能力檢測：轉染48h 時收集細胞，調整細胞懸液濃度到2.5×105個/ml，取200 μl 細胞懸液加入已鋪好的Martrigel（1∶8 稀釋）小室中繼續培養16 h。用95ml/dl 乙醇/甲醛和100ml/dl 甲醇依次處理后，用0.1g/dl 結晶紫染液染20 min， PBS 洗兩次后用棉簽擦拭小室內細胞，將小室倒置于顯微鏡下，隨機計數10 個視野中的細胞數。

1.3.7 流式細胞儀測周期和凋亡變化：MCF-7 細胞同步化后分別轉染重組質粒和空質粒，并設空白對照組，按照細胞周期試劑盒和凋亡試劑盒處理各組細胞，用Becton Dickinson 流式細胞儀檢測DNA-PI的熒光強度，發射光和激發光的波長分別是530nm和488nm；Cell Quest V.4.0 進行數據采集，Mod Fit LT 軟件系統分析細胞周期和G1, S, G2 期細胞比例，以及細胞凋亡在各種中的比例并進行數據統計。

1.3.8 腫瘤相關蛋白測定：按照SDS-PAGE 試劑盒說明檢測三組中PHB 高表達情況和腫瘤相關蛋白P53, Bcl-2, E2F-1 和ERBB2 的表達量，同樣，在UVP 中進行顯色，用Quantity one 軟件計算灰度值，進行數據處理。

1.4 統計學分析 計量資料采用Shapiro-Wilk 法檢驗數據的正態分布，所有數據均以均數±標準差（+s）表示，運用SPSS19.0 軟件處理數據，并用GraphPad Prime 5.0 作圖。兩獨立樣本間差異比較采用t檢驗，多個樣本組間差異比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩多重比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準為α=0.05（雙側）。

2 結果

2.1 重組質粒構建及細胞轉染 PCR 擴增后瓊脂糖凝膠電泳條帶大小處于750～1 000kb 之間，見圖 1A 所示，回收純化后進行DNA 測序，測序結果與NCBI 中一致。重組質粒 pEGFP-PHB 雙酶切后目的條帶位于837kb 左右，符合PHB 基因分子量大小，見圖1B。乳腺癌細胞系MCF-7呈多邊形，貼壁生長。轉染24h 后觀察載體熒光蛋白表達量，轉染效率可達75%以上，見圖1D。

2.2 Real time-PCR 及WesternBlot 檢測PHB 高表達 質粒轉染后OE 組，NC 組和MOCK 組提取總RNA 濃度分別為719, 552 和1 004.5ng/μl，A260nm/A280nm比值分別為1.97, 2.0 和1.99，RNA 瓊脂糖凝膠電泳可見28S, 18S 和5S 條帶，見圖2A。Real time-PCR 后各組PHB 的表達量見圖2B，OE組PHB 表達量明顯高于NC 組和MOCK 組，差異有統計學意義（F=790.5,P＜0.0001）。Western Blotting 結果顯示，OE 組PHB 蛋白表達明顯高于NC 組和MOCK 組，見圖2C，差異有統計學意義（F=6.206,P=0.034）。

圖2 Real time PCR 及Western blot 檢測PHB 高表達

2.3 MTT 檢測細胞生長 質粒轉染24, 48 和72h后的細胞生長曲線見圖3，PHB 高表達組細胞吸光度值均低于陰性對照組和空白對照組，差異有統計學意義（F=12.74,P=0.034;F=118.5,P＜0.001;F=19.22,P=0.002;）。PHB 在三個時間點的細胞生長抑制率分別為20.98%, 14.93%和62.94%，即PHB 過表達后，細胞生長受到抑制，細胞存活率降低。

圖3 MTT 法細胞生長曲線測定

2.4 Transwell 小室侵襲能力檢測 侵襲細胞固定染色后隨機計數10 個視野， OE 組細胞數為54.5±7.4 個，NC 組細胞數為66.0±12.6 個，MOCK 組細胞數為64.0±5.6 個，OE 組侵襲細胞數低于對照組，差異有統計學意義（t=3.221,P=0.012;t=4.057,P=0.003），對照組間差異無統計學意義（t=0.334,P=0.746）。

2.5 細胞周期和凋亡檢測 轉染后的細胞固定并用PI 染色，流式細胞儀檢測細胞周期。OE 組，NC組和MOCK組的G1期分別為（49.26±6.39）%, （51.36±4.78）% 和（54.41±2.37）%， 三組G1期比例差異無統計學意義（F=0.241,P=0.799）。S 期分別為（14.30±6.97）%，（27.07±4.44）%和（26.54±0.87）%，差異有統計學意義（F=4.872，P=0.039）。G2期分別為（34.76±3.51）%，（21.57±2.32）%和（19.04±2.83）%，差異有統計學意義（F=12.74,P=0.0342）。

轉染后收集細胞用凋亡試劑盒染色檢測各組細胞數量及凋亡比例。OE 組，NC 組和MOCK 組細胞凋亡率分別為（33.67±8.68）%，（12.13±3.76）%和（6.99±2.33）%，OE組的細胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統計學意義（F=18.992,P=0.003），NC 組與MOCK 組間差異無統計學意義（t=3.350,P=0.079）。

2.6 腫瘤相關蛋白檢測 SDS-PAGE 凝膠電泳結果見圖4。P53 和ERBB2 蛋白表達量OE 組高于NC組，差異有統計學意義（t=4.590,P=0.44；t=9.489,P=0.011）；Bcl-2 蛋白OE組低于NC組，差異有統計學意義(t=7.143,P=0.019)；E2F-1 蛋白水平OE 組與NC 組之間差異無統計學意義(t=2.175,P=0.162)。

圖4 腫瘤相關蛋白檢測

3 討論

抗增殖蛋白（Prohibitin，phb/PHB），亦稱阻抑素，因具有細胞增殖抑制功能而得名，是一種高度同源保守的蛋白質，在染色體上位于17q21，長11kb。其兩種亞型PHB1 和PHB2 相互纏繞形成指環樣結構，維持線粒體結構穩定性和功能完整性[2,8]。PHB 蛋白功能豐富多樣，參與細胞多個進程，包括增殖抑制、能量調節、轉錄調控、分化凋亡和免疫調控等[9]。近年來，乳腺癌已成為全球女性首位惡性腫瘤，發病率和致死率也逐年升高，在我國，其發病率明顯年輕化。自1992年PHB 基因多態性與乳腺癌易感性的研究開始，越來越多的學者關注其作用機制，日本學者KIM 等[10]從乳腺癌治療方面亦證實PHB 發揮重要作用。

本次研究結果顯示，PHB 高表達后細胞存活率降低，S 期的比例降低，這與大多數研究者的結果相符，表明PHB 抑制了乳腺癌細胞MCF-7 的生長，使細胞處于低增殖的狀態，這可能與S 期DNA 合成減少及G2/M 期細胞阻滯有關。S 期是細胞間期DNA 合成的重要時期，DNA 合成的不足或者缺陷將影響細胞分裂期的進行以及細胞功能完整性。有學者發現PHB 對細胞的增殖抑制主要是通過對正性調控因子E2F 家族蛋白的抑制和抑癌基因P53 的活化來實現的[10,14]，本次研究也發現PHB 高表達時，P53 表達水平增高（t=9.489,P=0.011），提示P53確實參與增殖抑制通路，而E2F-1 的表達未發生變化（t=2.175,P=0.162），不能支持 P53 作為E2F-1上游調控因子參與PHB 作用機制的觀點。PHB 可能通過P53 的途徑抑制細胞增殖，或是激活Ras-Raf-MEK-ERK 途徑來發揮抑制細胞增殖作用[9,13]，需要進一步深入研究和驗證。

除此以外，PHB 的高表達使得細胞凋亡增加，同時凋亡相關蛋白Bcl-2 水平減低，分析其原因可能是PHB 和Bcl-2 都具有穩定線粒體的功能，Bcl-2 的降低使得線粒體膜穩定性下降，線粒體外膜蛋白MOMP 和線粒體內膜蛋白如細胞色素C 的釋放增加，導致能量代謝障礙而引起細胞凋亡數量和比例增加。與乳腺癌侵襲性、治療及預后緊密相關的人類表皮生長因子ERBB2，即Her2 基因，可為Her2 陽性乳腺癌患者提供有效的治療效果[14]，針對Her2 陽性乳腺癌已有好的靶向藥物，包括曲妥珠 / 帕妥珠單抗等。在本次研究中，PHB高表達時Her2 蛋白水平增高，有望提高靶向藥物治療效果，可以增加激素和化療藥物的敏感性，同時降低乳腺癌的侵襲性，若PHB 和ERBB2 能夠聯合應用于Her2 陽性乳腺癌患者，將可能為乳腺癌治療開辟新的路徑。

由上述分析可知：PHB 高表達在細胞水平具有抑制細胞增殖的功能，同時使得細胞凋亡增加，整體表現出抑制乳腺癌細胞MCF-7 生長的現象。進而探索導致細胞生長抑制的分子水平變化，提示癌基因P53、正性轉錄因子E2F-1、凋亡相關蛋白Bcl-2 在PHB 對乳腺癌細胞的生長抑制過程中發揮重要作用。該研究為PHB 在乳腺癌細胞中的生物學功能提供了可靠資料，并對PHB 抑制乳腺癌細胞增殖的分子機制進行深入細致的研究，需要進一步進行動物實驗驗證。