三種方法評估替加環(huán)素對多重耐藥鮑曼不動桿菌體外藥敏結(jié)果分析

代鑫露，黃松音，李紅玉

（中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510120）

隨著抗生素的廣泛使用，多重耐藥鮑曼不動桿菌（multidrug resistantAcinetobacter baumannii，MDR-AB）日趨增多，給臨床抗感染治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1]。替加環(huán)素是目前為數(shù)不多的針對多重耐藥鮑曼不動桿菌的抗生素之一，然而各地區(qū)敏感性差異大，不同藥敏方法也存在差異，目前美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）仍無替加環(huán)素對鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，AB)的藥敏折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)[2]。本研究是以MIC test strip 法（以下簡稱MTS 法）為參考，分析比較替加環(huán)素不同藥敏方法對MDR-AB 藥敏結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 60 株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌菌株分離自2018年中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院住院病人臨床標(biāo)本，藥物敏感試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC25922）。

1.2 主要試劑和儀器 替加環(huán)素藥敏紙片（15 μg）購自英國OXOID 公司，替加環(huán)素MIC test Strip 試紙條（MTS，0.016～256 μg /ml）購自意大利Liofichem 公司，MH 瓊脂培養(yǎng)基、VITEK-2 全自動微生物分析儀及配套鑒定和藥敏卡均為法國梅里埃產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 VITEK-2 法：使用VITEK-2 全自動微生物分析儀及配套GN 卡鑒定細(xì)菌和AST-GN16 藥敏卡進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[3]。

1.3.2 紙片擴(kuò)散法：根據(jù)CLSI 推薦操作，取0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木壕鶆蛲坎加贛H 瓊脂培養(yǎng)基上[4]，室溫放置15 min 待表面干燥后將紙片替加環(huán)素藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，35 ℃孵育箱培養(yǎng)16～18 h，用游標(biāo)卡尺量取完整抑菌圈直徑。

1.3.3 MTS 法：操作同紙片擴(kuò)散法，將紙片換做MTS 試紙條貼于培養(yǎng)基中央，有刻度的一面朝上，讀取結(jié)果判斷：讀取橢圓型抑菌圈與試紙條的交界處刻度，即最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）[5]。

1.4 數(shù)據(jù)分析 由于CLSI 標(biāo)準(zhǔn)中還沒有替加環(huán)素體外藥敏試驗(yàn)檢測的操作指南和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，因此參照美國食品藥品監(jiān)督局（FDA）推薦折點(diǎn)進(jìn)行判讀。MIC≤2 mg/L為敏感（S），4 mg/L為中介（I），≥8 mg/L 為耐藥（R）。將MTS 法作為參考方法比較Vitek-2 法、紙片擴(kuò)散法與MTS 方法的一致性。分類一致性（caregorical agreement，CA）定義為被評估方法與MTS 法藥敏結(jié)果判斷一致的菌株百分比。非常重大誤差（very major error，VME）定義為被評估方法將耐藥誤判為敏感，重大誤差（major error，ME）定義為被評估方法將敏感誤判為耐藥，小誤差（minor error，mE）定義為被評估方法將中介報(bào)告為耐藥或敏感[6]。可接受的誤差范圍為：CA ≥90%，VME ≤1.5%，ME ≤3%，mE ≤10%。

2 結(jié)果

2.1 三種方法測定替加環(huán)素對MDR-AB 的藥敏結(jié)果及MIC 值分布 參照FDA 判斷標(biāo)準(zhǔn)MTS 法對多重耐藥鮑曼不動桿菌的敏感率為1.7%（1/60），中介率為75.0%（45/60），耐藥率為23.3%（14/60），MIC50 為6mg/L, MIC90 為8mg/L。Vitek-2 法敏感率為26.7%（16/60），中介率為65.0%(39/60)，耐藥率為8.3%（5/60），MIC50 為4mg/L，MIC90 為4mg/L。紙片擴(kuò)散法敏感率為1.7%（1/60），中介率為13.3%（8/60），耐藥率為85.0%（51/60）。

2.2 MTS 法與Vitek-2 法的MIC 結(jié)果比較 見表1。按照FDA 標(biāo)準(zhǔn)，Vitek-2 法的MIC 值較MTS 法低1 ～3 個(gè)稀釋度，易造成假敏感或假中介。

表1 MTS 法與Vitek-2 法的MIC 結(jié)果比較[株（%）]

2.3 兩種方法與MTS 法測定結(jié)果比較 見表2。以MTS 法為參考，將其他兩種方法與之比較，按FDA 標(biāo)準(zhǔn)，Vitek-2 法和紙片擴(kuò)散法的CA 均＜90%，mE 均＞10%，紙片擴(kuò)散法ME 為1.7%，Vitek-2 法的VME 為1.7%，提示Vitek-2 法和紙片擴(kuò)散法不適合檢測替加環(huán)素的敏感性。

表2 MTS 法與其他2 種方法檢測結(jié)果比較 ［株（%）］

3 討論

替加環(huán)素是一種新上市的廣譜抗生素，它能有效治療碳青霉烯耐藥菌株及多種復(fù)雜耐藥菌株[7-8]。然而近些年卻出現(xiàn)了對替加環(huán)素不敏感菌株，甚至在一些沒有使用替加環(huán)素的地區(qū)也出現(xiàn)了耐藥，其耐藥性的發(fā)生、發(fā)展可能與這些抗生素的選擇性壓力有關(guān)[9-10]。目前，針對替加環(huán)素體外藥敏試驗(yàn)，不同方法、不同判定折點(diǎn)間存在較大的差異。因此，本研究對臨床MDR-AB 用不同檢測方法檢測替加環(huán)素的藥敏結(jié)果進(jìn)行比較，為本地區(qū)替加環(huán)素的體外藥敏試驗(yàn)提供參考依據(jù)。

目前肉湯稀釋法被認(rèn)為是檢測替加環(huán)素敏感性的金標(biāo)準(zhǔn)[1]，但該方法操作繁瑣，不適宜臨床大規(guī)模檢測。Vitek-2 由于自動化、高通量，廣泛應(yīng)用于臨床對細(xì)菌的鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)。但是多項(xiàng)研究顯示Vitek-2 的鑒定效果存在一定的誤差[11-12]。熊安英等[13]評估了Vitek-2 系統(tǒng)對肺炎鏈球菌的藥敏診斷價(jià)值，與MTS 法相比，二者對青霉素MIC 在0.06～1.00 mg/L 的CA 為100%，但當(dāng)MIC＞2.00 mg/L 時(shí)，CA 僅為46.0%，出現(xiàn)了較多的假敏感和中介現(xiàn)象。同樣的，黃曉春等[14]以微量肉湯法為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)Vitek-2 檢測鮑曼不動桿菌對阿米卡星的敏感度出現(xiàn)了50% 的重大誤差，提示Vitek-2 在檢測鮑曼不動桿菌對阿米卡星的敏感性時(shí)有局限性。本研究結(jié)果顯示，Vitek-2 法檢測的敏感率為26.7%，但MTS 法僅為1.7%，同時(shí)Vitek-2 測得的替加環(huán)素對MDR-AB 的MIC 值較MTS 低1～2 個(gè)稀釋度，出現(xiàn)了較多的假敏感，提示其對于檢測替加環(huán)素的MIC 值有限。分析其原因，可能與Vitek-2 的檢測原理有關(guān)，Vitek-2 是通過檢測3～4 個(gè)抗生素濃度進(jìn)而預(yù)測出細(xì)菌6 個(gè)不同的生長模式，最終提供6 個(gè)MIC 值，但這3～4 個(gè)抗生素濃度可能并不是菌株的生長折點(diǎn)，因此可能會出現(xiàn)假敏感現(xiàn)象，另外由于Vitek-2 采用光電比濁法進(jìn)行藥敏檢測，結(jié)果會存在拖尾現(xiàn)象，易將中介或耐藥誤報(bào)為敏感或中介。這些都有可能使Vitek-2法的檢測結(jié)果出現(xiàn)一定誤差。

紙片擴(kuò)散法操作簡便且成本較低，但易受多種因素的影響，如接種量、抗生素含量、瓊脂厚度等[15]。潘楚芝等[16]比較了紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法檢測MDR-AB 對替加環(huán)素的敏感性，發(fā)現(xiàn)二者存在較大差異，該研究認(rèn)為差異原因可能與紙片擴(kuò)散法檢測腸桿菌科細(xì)菌不同的折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，并推薦當(dāng)抑菌環(huán)直徑＞12 mm 時(shí)判定為敏感。而目前常用的3種標(biāo)準(zhǔn)（美國FDA推薦標(biāo)準(zhǔn)、Jones法、Kulah法）判定敏感的標(biāo)準(zhǔn)均＞16 mm。本研究結(jié)果表明，紙片擴(kuò)散法對MDR-AB 的耐藥率、中介率上升，敏感率下降。mE 為61.6%，超出了可接受范圍，CA僅為36.7%，一致率較低，但多數(shù)菌株為MTS 法敏感而紙片擴(kuò)散法中介或MTS 法中介而紙片擴(kuò)散法耐藥，未出現(xiàn)MTS 法耐藥而紙片擴(kuò)散法敏感的結(jié)果。有國內(nèi)外研究[17-18]報(bào)道紙片擴(kuò)散法可能高估了替加環(huán)素的中介率和耐藥率，本文出現(xiàn)的mE 為61.6%可能與此有關(guān)。

綜上所述，對于多重耐藥鮑曼不動桿菌，Vitek-2 法和紙片擴(kuò)散法均不適合檢測替加環(huán)素的敏感度，Vitek-2 法和紙片擴(kuò)散法測定的中介和耐藥菌株仍需要用MTS 法確認(rèn)。本研究的菌株來源同一家醫(yī)院且樣本量少，仍需多中心大樣本的研究證實(shí)。