2015-2019年兒童呼吸道感染嗜血桿菌分離檢出及耐藥性變遷分析

趙智凝，張 偉，張小龍，王小艷（中國人民解放軍空軍第九八六醫院，西安 710054）

嗜血桿菌（Haemophilus）是一群無動力、無芽孢的革蘭陰性短桿菌或球桿菌，常常引起人類急性咽炎、喉炎、氣管炎和肺炎等化膿感染及嚴重的繼發感染。兒童由于鼻和鼻腔相對短小、鼻淚管和咽鼓管短等生理特點，且免疫功能尚未完善，因此兒童更容易被該菌屬病原菌所侵襲，產生相應癥狀。多項研究顯示嗜血桿菌感染是導致兒童社區獲得性肺炎的常見原因[1-3]。近年來，隨著臨床上抗生素的大量使用，導致該菌屬細菌的耐藥率不斷升高[4]，增加了治療的難度，且該菌屬細菌的耐藥機制復雜，使得臨床治療更加棘手。因此，嗜血桿菌的臨床分布和耐藥性的研究對臨床治療具有非常重要的意義。為了深入了解嗜血桿菌在呼吸道感染患兒中的檢出情況及耐藥現狀，本文就2015～2019年本院門診及住院患兒臨床標本中分離到的嗜血桿菌的臨床分布特征及藥敏試驗數據進行分析, 以更好地指導臨床合理用藥。

1 材料和方法

1.1 研究對象 2015年1月～2019年12月期間到兒科門診就醫或住院患兒4 575 例送檢標本中共分離出嗜血桿菌233 例，女性118 例，男性115 例。各年齡段分布特征為0 ～1 歲5 例，1 ～3 歲72 例，3 ～5 歲61 例，5 ～8 歲48 例，8 ～12 歲42 例，≥12 歲5 例，平均年齡5.42 ± 2.93 歲。患兒生理鹽水漱口后留取晨痰于無菌痰杯中或生理鹽水清潔口腔后用無菌咽拭子采集咽喉部標本送檢。同一患兒選取第一次送檢標本排除其余重復標本。

1.2 儀器與試劑 哥倫比亞血瓊脂平板和巧克力瓊脂平板購于鄭州安圖生物工程有限公司。藥敏紙片購于溫州康泰生物有限公司。鑒定采用法國生物梅里埃公司VITEK-2 compact 全自動微生物鑒定儀及配套的嗜血桿菌（NH）鑒定卡。

1.3 方法

1.3.1 培養及鑒定：取哥倫比亞血瓊脂平皿和巧克力平皿接種患兒痰標本或咽拭子標本，同時涂片后行革蘭染色鏡檢，選取高倍視野下見到白細胞吞噬革蘭陰性短桿菌或球桿菌標本的病原菌進行進一步鑒定及藥敏試驗。

1.3.2 體外藥敏試驗：對臨床標本中分離出來的嗜血桿菌在巧克力瓊脂平板上進行傳代培養，同時于哥倫比亞血瓊脂平板做生長對照實驗。選取青霉素類的氨芐西林，β-內酰胺類復合制劑的氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢菌素類的頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟，單環β-內酰胺類的氨曲南，碳青霉烯類的亞胺培南、美羅培南，大環內脂類的克拉霉素、阿奇霉素，四環素類的四環素，氟喹諾酮類的左氧氟沙星、環丙沙星，磺胺類的復方新諾明、利福平及氯霉素20 種抗生素，藥敏試驗采用紙片擴散法在巧克力平皿上進行。藥敏實驗結果根據美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)藥物敏感性實驗標準文件及每年更新內容中嗜血桿菌藥物敏感性試驗及折點判斷標準執行。

1.3.3 β- 內酰胺酶測定：采用頭孢硝噻吩（Nitrocefin）紙片法進行測定。β-內酰胺酶判定陽性為10 min 內紙片變紅，否則為陰性。陰性對照采用大腸埃希菌ATCC25922，陽性對照為大腸埃希菌ATCC35218。

1.3.4 質控菌株：質控菌株為流感嗜血桿菌ATCC49766 和ATCC49247。

1.4 統計學分析 應用WHONET 5. 6 軟件進行藥敏試驗結果的數據分析。

2 結果

2.1 嗜血桿菌檢出率 2015～2019年233 株嗜血桿菌屬細菌培養陽性檢出率分別為2.7%，4.3%，4.9%，5.8% 和6.9%，總檢出率為5.1%（233/4 575）。嗜血桿菌的檢出率由2015年的23 株（2.7%）到2019年的80 株(6.9%)，呈現逐年上升趨勢。

2.2 嗜血桿菌的構成比 見表1。從2015 ～2019年，嗜血桿菌屬細菌檢出以副流感嗜血桿菌（51.1%）和流感嗜血桿菌（36.9%）為主，其他檢出菌包括溶血嗜血桿菌（6.4%）、惰性嗜血桿菌(3.0%)、嗜沫嗜血桿菌(2.6%)，逐年比例雖有波動，但差異無統計學意義。

表1 兒童痰培養嗜血桿菌的檢出率[n（%）]

2.3 流感嗜血和副流感嗜血桿菌的耐藥情況 見表2。流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥率最高達到75%、復方新諾明64.3%，接下來是四環素和阿莫西林/克拉維酸，耐藥率為42.9%,以上抗生素已不適宜臨床經驗用藥；而頭孢哌酮/舒巴坦及第三、四代頭孢菌素，左氧氟沙星，亞胺培南和阿奇霉素耐藥率均低于18%，可以用于流感嗜血桿菌感染患兒的治療。副流感嗜血桿菌對氨芐西林、復方新諾明、環丙沙星和阿莫西林/克拉維酸的耐藥率均超過50%，分別為76.2%，71.4%，54.8%和50%。此外，副流感嗜血桿菌對氨芐西林/舒巴坦、四環素、克拉霉素、氯霉素、頭孢呋辛、氨曲南和美羅培南的耐藥率超過30%；對頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、阿奇霉素、利福平敏感率均高于80%，可作為臨床治療藥物。

表2 流感嗜血桿菌與副流感嗜血桿菌對常用抗生素耐藥情況統計（%）

2.4 嗜血桿菌耐藥機制 見表3。86 株流感嗜血桿菌β-內酰胺酶2015～2019年陽性率分別為33.3%，36.4%，43.8%，45.5%，50.0%， 總 陽 性率44.2%( 38/86)。119 株副流感嗜血桿菌β-內酰胺酶2015～2019年陽性率分別為28.6%，35.7%，40.0%，48.3%和54.8%，總陽性率45.4%( 54/119)。β-內酰胺酶測定總陽性率為44.9%（92/205），且陽性率呈現逐年上升趨勢。β-內酰胺酶測定陽性株全部對氨芐西林耐藥，β-內酰胺酶陰性株中氨芐西林耐藥率為22.0%。

表3 嗜血桿菌β-內酰胺酶及氨芐西林的耐藥情況[n（%）]

3 討論

嗜血桿菌屬細菌寄生在人和多種動物的黏膜，在人體內主要寄生在咽喉及口腔黏膜，少見于消化道和生殖道，屬苛養性細菌，對營養要求嚴格。從臨床標本中分離出的新鮮菌株多呈球桿狀、雙球狀或短鏈狀，陳舊培養物中的菌株呈長桿狀或長絲狀等多形性。呼吸道標本中的嗜血桿菌在初代培養時，受到革蘭陽性細菌的抑制（營養競爭及菌素作用）菌落細小不易與其他細菌相互區別，這是造成嗜血桿菌分離率低的直接原因。在巧克力培養基中加入萬古霉素可抑制了革蘭陽性細菌的生長，增加對嗜血桿菌的選擇性，菌落較大易于識別，從而大大提高了嗜血桿菌的分離率，這對臨床嗜血桿菌的分離非常重要。嗜血桿菌屬細菌常常引發原發性和繼發性感染，包括肺炎、腦膜炎、中耳炎[5]等。從2015年1月～2019年12月我院兒科門診及住院患兒臨床標本中共分離出嗜血桿菌屬細菌233 株，由逐年檢出率可見呈明顯的上升趨勢。從檢出比例來看，我院兒科患者感染以副流感嗜血桿菌為主，其次是流感嗜血桿菌，其后依次是溶血嗜血桿菌、嗜沫嗜血桿菌和惰性嗜血桿菌。

本研究發現嗜血桿菌屬細菌以流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌為例，對20 種抗生素耐藥率均有逐年增高的趨勢，其中流感嗜血桿菌對氨芐西林和復方新諾明、四環素及阿莫西林/克拉維酸耐藥率較高，這與李志浩等[6]的研究結果一致；對頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、阿奇霉素和左氧氟沙星耐藥率比較低，可供臨床用藥參考。副流感嗜血桿菌對氨芐西林、復方新諾明、環丙沙星和阿莫西林/克拉維酸的耐藥率均超過50%，上述抗生素已不適宜經驗用藥。雖然第三、四代頭孢菌素的敏感率都在80%以上，但從逐年耐藥率數據可見，敏感率在逐年下降，因此該類藥物在臨床應用應該謹慎，以避免耐藥率的進一步上升。近年來，嗜血桿菌的產酶率在不斷上升，本研究中發現流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌的β-內酰胺酶產酶率隨著細菌檢出率的逐年增高也在不斷增高，流感嗜血桿菌由2015年的33.3%到2019年的50%，副流感嗜血桿菌則由2015年的28.6%到2019年的54.8%，直接導致該菌屬細菌對氨芐西林的耐藥率不斷上升，已達到或超過75%。對氨芐西林的耐藥率上升與β-內酰胺酶產酶率上升具有一致性，說明我院兒科檢出的嗜血桿菌對氨芐西林的耐藥機制主要是產生β-內酰胺酶。近年來，在嗜血桿菌產酶率不斷增高的同時，β-內酰胺酶陰性氨芐西林耐藥流感嗜血桿菌（β-lactamase-negative ampicillin-resistant Haemophilus influenzae, BLNAR）的檢出率也在增高，給臨床治療帶來困難。在本研究中BLNAR 檢出率為25.6%( 22 /86)，β-內酰胺酶陰性耐氨芐西林副流感嗜血桿菌檢出率為19.3%( 23 /119)，這已經明顯高于蔡淑梅等[7]2015年報道的數據，可見嗜血桿菌屬細菌的耐藥形勢越來越嚴峻。

流感嗜血桿菌對氨芐西林的耐藥機制比較復雜，主要是被細菌產生β-內酰胺酶分解而失活[8]。其中由質粒介導的TEM-1 型酶較多見，而ROB-1型酶較為少見[9]。BLNAR 的耐藥機制主要是由于細菌細胞膜表面的青霉素結合蛋白（PBPs）發生點突變或基因重組[10]，導致對β-內酰胺類抗生素親和力降低而引起耐藥。另外，細菌外膜孔蛋白數量和特性的改變導致細胞膜通透性下降[11]，藥物無法進入細胞內發揮作用也會產生耐藥，這種耐藥可與β-內酰胺酶協同作用，并具有多重耐藥性。另有學者發現基因突變在嗜血桿菌對多種抗生素的耐藥中起到重要作用，如基因acrR 編碼的外排泵AcrAB 對大環內酯類抗生素的耐藥機制中具有重要作用[12]；floA 基因突變引起流感嗜血桿菌對甲氧芐氨嘧啶的耐藥性[13]，而對磺胺的耐藥性是由染色體編碼在SulA 類似物中的基因突變引起[14]；tet（B）基因編碼的外排泵系統及產生核糖體保護蛋白或染色體突變導致外膜通透性下降與四環素的耐藥機制密切相關[15]；cat 基因編碼的質粒介導的氯霉素乙酰基轉移酶引起嗜血桿菌對氯霉素的耐藥[16]等等。

綜上所述，流感嗜血桿菌仍是兒童呼吸道感染的主要致病菌，各個地區其檢出率和耐藥率均呈逐年升高趨勢，因此必須在全國范圍內提高對嗜血桿菌的分離培養、鑒定和藥敏的重視，根據藥敏試驗的數據有針對性地合理應用抗生素才是減緩細菌耐藥性產生的關鍵。