南瓜黃色素提取工藝的響應面法優化及其在碳酸飲料中的應用

謝 婧，陳賢錚，盧建國

（廣東科貿職業學院，廣東 廣州 510430）

南瓜是一種蔓性草本植物，在我國種植廣泛，是一種營養價值高低脂功能性食品[1]，其中南瓜黃色素就是從南瓜提取的一種脂溶性色素，富含類蘿卜素、葉黃素和玉米黃素等多種黃色色素成分[2]，可作為天然色素的來源。隨著人們對天然配料（All-natural）和清潔標簽（Clean label）的日益需求，目前市場天然色素逐步得到人們的青睞，天然色素取代合成色素已成為必然。但是由于天然色素色澤不穩定，在其使用過程中容易受各種因素（如光照、溫度、氧化、pH、介質極性、金屬離子、添加劑等）的影響[3]。同時由于大多數食品體系都以水作為基質，因此水溶性的功能因子可以直接以溶液的形式添加于食品中并在食用過程中被人體吸收[4]，因而也具有較好的生物利用率。

南瓜黃色素是脂溶性功能因子，在功能食品中的應用由于其溶解性和穩定性而受到限制，功能因子在食品中的傳遞是生產功能食品的關鍵。本研究采用少加工的溶劑浸提法，利用食品級乙醇提取南瓜黃色素，以浸提時間、pH、溫度和料液比為單因素進行梯度試驗[5]，通過響應面試驗得到提取率較高的南瓜黃色素提取工藝參數[6-7]，再利用多重乳液[8-9]作為的傳遞系統制備碳酸飲料，為南瓜黃色素在食品中應用提供了一套較為可行的方案。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

南瓜：購于江南水果批發市場（廣州市白云區）；白砂糖：北京中糖世紀食品有限公司產品；檸檬酸：食品級，廣州廣檸貿易有限公司產品；無水乙醇（99.5%）：食品級，上海森旭化工科技有限公司產品；單寧酸：諾維信（中國）生物技術有限公司產品；聚甘油蓖麻醇酯（PGPR）：凱瑞生化科技產品；丙三醇（甘油）：食品級，鄭州裕和食品添加劑有限公司產品；葵花籽油：購于廣州華潤萬家超市（上海佳格食品有限公司生產）。

1.1.2 儀器與設備

DHG-9123A 型臺式鼓風干燥機箱，722S 可見分光光度計，HH-4 型恒溫水浴鍋，ZFQ85A 旋轉蒸發儀，AL204 型電子天平，BX51 光學顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 南瓜黃色素提取工藝流程

新鮮南瓜→去皮→護色→干燥→粉碎→南瓜粉→浸提→過濾→濃縮→干燥→南瓜黃色素產品[10]

1.2.2 南瓜黃色素提取操作要點

將新鮮南瓜洗凈去皮切分成2 cm×2 cm 小方塊，熱燙2 min 護色，放入鼓風干燥機箱60 ℃烘干24 h，干燥完成后粉碎備用。稱取備好的南瓜粉5 g，加入一定量乙醇浸提取[11]，提取結束后抽濾，即得南瓜黃色素原液。

1.2.3 南瓜黃色素最大吸收波長的確定

將南瓜黃色素乙醇提取液適當稀釋，以無水乙醇作空白，用可見分光光度計在400～500 nm 處進行光譜掃描[12-13]，確定其最大吸收波長，并以其為最佳吸收波長。

1.2.4 單因素試驗設計

1.2.4.1 最佳浸提劑濃度的篩選

稱取6 份預處理的南瓜粉，每份5.00 g，分別用50%、60%、70%、80%、90%、99.5%（無水乙醇）的乙醇提取[14]，提取時間100 min，提取溫度60 ℃，料液比1∶10（g/mL），pH 為 5，得到濾液稀釋到相同體積后，在最佳吸收波長下測其吸光度。

1.2.4.2 料液比對南瓜黃色素提取的影響

稱取7 份預處理的南瓜粉，每份5.00 g，用無水乙醇浸提劑以不同料液比（1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11（g/mL）) 加入樣品中[15]，提取時間 100 min，提取溫度60 ℃，pH 為5，得到濾液后稀釋到相同體積（100 mL），在最佳吸收波長下測其吸光度，得其最大吸光度，并以其料液比為最佳料液比。

1.2.4.3 pH 對南瓜黃色素提取的影響

稱取8 份預處理的南瓜粉，每份5.00 g，以調節到不同 pH（4、5、6、7、8、9、10、11）的無水乙醇為浸提試劑[16]，提取時間 100 min，提取溫度 60 ℃，料液比1∶10（g/mL），得到提取液稀釋到相同體積后，在最佳吸收波長下測其吸光度。

1.2.4.4 浸提溫度對南瓜黃色素提取的影響

稱取5 份預處理的南瓜粉，每份5.00 g，用無水乙醇浸提劑，以料液比 1∶10（g/mL），在不同溫度下（40、50、60、70、80 ℃）進行提取[17-18]，pH 為 5，得到浸提液稀釋到相同體積后，在最佳吸收波長下測其吸光度。

1.2.4.5 浸提時間對南瓜黃色素提取的影響

稱取7 份預處理的南瓜粉，每份5.00 g，以料液比 1∶10（g/mL）加入無水乙醇，在 60 ℃下恒溫浸提不同時間（20、40、60、80、100、120、140 min）[19-21]，pH 為5，得到浸提液稀釋到相同體積后，在最佳波長下測其吸光度。

1.2.5 響應面優化提取工藝

根據單因素結果，采用Box-Behnken 中心組合試驗方案進行三因素三水平試驗[22-24]，進行響應面分析結合實際確定最佳提取條件。提取溫度、pH、料液比 3 個因素為自變量，分別以A、B、C表示，以-1、0、1代表各自變量的低、中、高水平，設計方案見表1。

表1 因素水平編碼表Table1 Factors and levels in central composite design

1.2.6 南瓜黃色素多重乳液的制備

將1 mg/mL 單寧酸、甘油為60%、蒸餾水組成內水相，分散至完全溶解，得到內部水相W1。將南瓜黃色素原液按油相的1%（質量分數）、親油性乳化劑聚蓖麻油酸甘油酯（PGPR）按8%溶于葵花籽油乳化[25]，得油相O，按內部水相W1與油相O 的質量比為4∶6，將內部水相完全分散于油相中，調節剪切乳化強度8 000 r/min[26]，乳化時間 6 min，每 2 min 間隔，制得W1/O 型乳狀液作為第一相；最后將W1/O 型乳狀液(第一相)與外部水相質量比為 3∶7，將 W1/O 滴加至含有5%的親水性乳化劑Tween 80 外水相中[27]，乳化強度2 000 r/min，乳化時間1 min，攪拌制得南瓜黃色素W1/O/W 多重乳液[28-29]。

1.2.7 南瓜黃色素碳酸飲料的工藝

白砂糖14%（質量分數），檸檬酸0.15%（質量分數），南瓜提取黃色素（按碳酸飲料添加限量），山梨酸鉀0.03%（質量分數），碳酸水1 000 g 定容。

1.2.8 數據處理

采用Minitab 17 軟件對數據進行響應面設計和處理，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 南瓜黃色素提取最佳吸收波長的確定

由圖1 可知，南瓜黃色素在400～500 nm 的波長范圍內出現最大吸收峰，440 nm 波長下吸光度最大。因此，選定440 nm 作為測定吸光度的最佳波長。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇濃度的選擇

由圖2 可知，隨著乙醇濃度的增大，提取效果遞增，乙醇濃度最高時，溶液極性變小，提取效果也最好。因此，確定濃度99.5%為最佳濃度，即以無水乙醇為浸提劑。

2.2.2 料液比對南瓜黃色素提取效果的影響

由圖3 可知，南瓜提取黃色素與乙醇浸提液比例分別為 1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11（g/mL）的情況下，提取效果各不相同，隨著提取溶劑添加量的增大，吸光度逐步上升后趨于平緩，在料液比1∶6（g/mL）時黃色素提取效果最佳，可進一步優化。乙醇浸提液添加量過低時可能南瓜黃色素不能與提取劑分完全溶出，隨著提取劑用量的增大，由于南瓜細胞破碎程度減小，提取效果反而略微降低趨于平緩，提取效果反而降低，而且生產成本過高。因此，選擇適宜的料液比為 1∶6（g/mL）。

2.2.3 不同pH 的乙醇浸提液對南瓜黃色素提取效果的影響

由圖4 可知，調節乙醇浸提液pH 對南瓜黃色素提取的有一定影響，在酸性條件下吸光度較高，堿性條件下吸光度較低但比較穩定，在pH 為5 時提取率較高。

2.2.4 浸提溫度對南瓜黃色素提取效果的影響

由圖5 可知，在浸提溫度40～60 ℃范圍內，提取液吸光度隨著溫度的增加而升高，但在浸提溫度60～80 ℃卻呈現負相關，在60 ℃下南瓜黃色素的提取效果達到最佳狀態，這能避免提取溫度過高而引起的資源浪費，在試驗過程中可進一步優化。

2.2.5 浸提時間對南瓜黃色素提取效果的影響

由圖6 可知，提取時間對南瓜黃色素提取效果的影響呈正相關，但到達100 min 后趨于平穩，考慮到生產中的能耗和效率，因此最佳提取時間選擇為100 min即可。

2.3 響應面優化南瓜黃色素的提取工藝

2.3.1 中心組合試驗設計與結果

按照Box-Behnken 試驗方案進行三因素三水平試驗，結果見表2。將所得的試驗數據采用Minitab 17軟件進行多元回歸擬合，得到以吸光度為目標函數的二次多項回歸方差：南瓜黃色素提取物吸光度對色素A浸提溫度、B浸提液pH、C料液比的二次多項回歸方程：吸光度（A）=-10.41+0.303 3A+0.358B+0.348C-0.002 396A2+0.067 4B2-0.093 6C2-0.010 83AB+0.012 73AC-0.043 7BC。

表2 Box-Behnken 試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken test design and results

由表3 回歸模型方差的分析結果可知，模型的F值=10.98，P＜0.01，表明模型極顯著，并且失擬項不顯著（P＞0.05），說明該回歸方程對數據進行了較好擬合，可以用該模型分析和預測南瓜提取黃色素的結果，模型回歸方程系數的顯著性分析表明，A2極顯著（P＜0.01），A、C、C2、AB、AC顯著（P＜0.05），各因素對提取南瓜黃色素影響的主次順序為：C＞A＞B，即料液比的影響最大，提取溫度次之，浸提液pH 的影響最小。

2.3.2 各因素之間交互作用曲面圖及分析

響應曲面坡變化和等高線能反映因素的交互作用，將建立的回歸模型的任一因素固定在零水平，探討另外兩因素的交互影響，得到二次回歸方程的響應面圖及其等高線圖，如圖7～9 所示。

等高線圖表示同一橢圓形區域內，南瓜黃色素的提取量是相同的，橢圓形區域中心的提取量最大，并逐漸向邊緣減少，如果響應面陡峭表示因素條件變化時，響應值極其敏感；反之，因素對響應值不敏感。等高線圖為橢圓形表示交互作用明顯，反之不明顯可以忽略。

由圖7 可知，處理提取溫度在60～70 ℃范圍內，浸提液pH 在4～5 范圍內時，兩者存在顯著的作用，南瓜黃色素提取量隨著兩個因素的增加而增加；而提取溫度在 70～80 ℃范圍內，浸提液 pH 在 5～6 范圍內時，南瓜黃色素提取量隨著兩個因素的增加而減少。由圖8 可知，提取溫度在60～80 ℃范圍內，料液比在1∶5～1∶7（g/mL）范圍內時，兩者存在顯著性的增效，南瓜黃色素提取物隨著提取溫度和料液比的降低而增加。為了確定最佳點的值，對模型進行分析，以得到最高南瓜黃色素的最佳提取工藝參數，經分析得出最佳提取條件為：提取溫度63.03 ℃，提取液pH 6.0，料液比 1∶5.0（g/mL）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

2.4 驗證試驗

為檢驗試驗的可靠性，采用上述最優提取參數進行南瓜黃色素的提取，同時考慮到提取試驗的可控性和可行性，對最佳工藝參數進行修正：采用提取溶劑濃度99.5%（即無水乙醇），提取溫度63 ℃，提取液pH 6，料液比 1∶5（g/mL），提取時間 100 min，按照該工藝提取的南瓜黃色素吸光度值為1.720 1，與吸光度預測值1.769 8 比較可知，響應面法所得的優化工藝參數準確可靠，具有實用價值。

2.5 南瓜提取黃色素在碳酸飲料中的應用

將南瓜提取黃色素按“1.2.6”中的方法制備成南瓜黃色素多重乳液，由圖10 可見，南瓜黃色素多重乳液黃色柔和美觀，在100 倍光學顯微鏡下觀察乳液質構，油相包裹均勻，乳液形狀較為穩定。

將南瓜提取黃色素多重乳液應用于碳酸飲料中，按“1.2.7”工藝制作碳酸飲料樣品，置于37 ℃恒溫培養箱內儲存20 d，每隔5 d 取出用分光光度計測吸光值，結果如表4 所示。

表4 南瓜黃色素碳酸飲料在37 ℃儲存的吸光度變化Table 4 The change of absorbance of pumpkin yellow carbonate beverages stored at 37 ℃

由表4 可見，儲存1 d 時，南瓜黃色素碳酸飲料的吸光度為1.123，20 d 測飲料吸光度為1.024，在恒溫時間內碳酸飲料吸光度并無明顯降低，外觀也無明顯變化，可為天然色素在碳酸飲料中的穩定性的應用提供一定的理論基礎。

3 結 論

上述試驗結果表明：采用乙醇浸提法提取南瓜黃色素的最佳吸收波長為440 nm；采用Box-Behnken中心組合試驗方案進行三因素三水平試驗，進行響應面分析結合實際確定最佳提取參數為：提取溶劑濃度99.5%（即無水乙醇），提取溫度 63 ℃，提取液 pH 為6，料液比 1∶5（g/mL），提取時間 100 min；將南瓜中提取的黃色素制備南瓜黃色素多重乳液，再將其應用于碳酸飲料中，穩定性好。因此，利用響應面法分析南瓜黃色素的提取工藝，科學合理，而且方法簡單高效，為今后進一步研究打下了堅實基礎，也為南瓜黃色素在食品中應用及工業化生產提供了理論基礎。