大孔樹脂對短梗五加多酚的純化效果及多酚的抗疲勞作用研究

劉 琦

（南昌理工學院體育學院，江西 南昌 330044）

短梗五加（Acanthopanax sessiliflorus）為傘形目五加科五加屬植物，富含多糖、氨基酸、花色苷、槲皮素、綠原酸、酚酸等化合物[1-2]，因其具有益氣安神、活血通絡等功效而被加工成各類食品或藥品使用。近年來有研究發現，其果實中多酚具有抗氧化、降血糖及增強機體免疫功能等活性[3-5]。肖鳳艷等[6]采取減壓回流提取該植物果實中多酚，發現其具有較好的抗疲勞效果。但一般提取物中仍含有較多鞣質、蛋白質等雜質，使得多酚含量偏低，進而影響產品的功效。

大孔樹脂吸附分離綜合了機械篩分與化學吸附的優點，具有選擇性高、干擾因素少、可重復循環利用等特點，被廣泛用于天然產物活性成分的分離和純化[7-8]。本研究在短梗五加果多酚提取研究的基礎上，探討大孔樹脂純化短梗五加多酚提取物的最佳工藝條件，同時研究其對運動后小鼠的抗疲勞作用效果，為短梗五加多酚的進一步開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

短梗五加果：采購于遼寧建聯醫藥連鎖有限公司；綠原酸：定量分析用，中國藥品生物制品檢定所產品；乙醇、甲醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司產品；AB-8、DM-130 大孔樹脂：天津浩聚樹脂科技有限公司產品；H-103、D-101 大孔樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司產品；NKA-9、ADS-21 大孔樹脂：天津西金納環保材料科技有限公司產品；血尿素氮（BUN）試劑盒、乳酸（BLA）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑、肌糖原（MG）和肝糖原（HG）試劑盒：南京建成生物工程研究所產品。試驗用水為超純水。

試驗動物：健康雄性小鼠 30 只，體重（7±2）g，由江西省實驗動物中心提供，生長環境溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%。

1.1.2 儀器與設備

T6 型紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司產品；FA2204B 型電子天平：上海精密科學儀器有限公司產品；878-B 型多功能粉碎機：常州國華電器有限公司產品；RE-6000AT 型旋轉蒸發儀：杭州振和科學儀器有限公司產品；SCIENTZ-10ND型冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司產品；KL-211D 型恒溫振蕩器：上海凱朗儀器設備有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制備

干燥的短梗五加果粉碎后，過80 目篩，稱取50 g，加入750 mL 50%乙醇溶液，80 ℃回流提取60 min 后過濾，提取兩次，合并濾液減壓回收乙醇后，冷凍干燥備用[6]。

1.2.2 定量分析

1.2.2.1 多酚標準曲線的繪制

不同產物的多酚含量以綠原酸當量表示，準確稱取10.0 mg 綠原酸標準品，以甲醇溶解定容至50 mL容量瓶后，分別準確移取 1、2、5、10、15 mL 標準品溶液置于50 mL 容量瓶內，另加入5%亞硝酸鈉溶液2.0 mL，靜置6 min 后再加入10%硝酸鋁溶液2.0 mL，混勻后，靜置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液8.0 mL，靜置 15 min，加水定容，即得 0.004 ～ 0.06 mg/mL 綠原酸標準溶液，然后于520 nm 波長處測定吸光度值，繪制標準曲線[9]，得到線性方程為：y=11.253x+0.015 2（R2=0.999 5，y為吸光度，x為濃度值）。

1.2.2.2 多酚含量的測定

提取物和純化物樣品多酚含量測定：準確稱取樣品10.0 mg，采用甲醇溶解，并定容至50 mL 容量瓶后，準確移取20 mL 溶液至50 mL 容量瓶內，加入顯色劑后，加水定容至50 mL，于520 nm 波長處測定吸光度，代入標準曲線，計算得到樣品多酚含量，平行測定 3 次。

靜態吸附液和動態流出液中多酚含量測定：使用旋轉蒸發儀去除靜態吸附液與動態流出液中的乙醇，后冷凍干燥，按照上述步驟加入顯色劑后，于520 nm波長處測定吸光度值，根據標準曲線方程，計算樣品的多酚含量，平行測定3 次。

1.2.3 樹脂預處理

將大孔樹脂于90%乙醇中浸泡24 h，充分溶脹后濕法裝柱，然后用90%乙醇反復沖洗，直至流出液與水混合（V液∶V水=1∶5)無白色渾濁出現，再用水洗至無乙醇氣味，加入3%鹽酸浸泡3 h，用水洗至中性；再用3%氫氧化鈉溶液浸泡3 h，用水洗至中性，備用[10]。

1.2.4 大孔樹脂的型號篩選

準確稱取一定質量的粗提物溶解至無水乙醇中，配制成0.1 mg/mL 吸附液。準確稱取10.0 g 六種不同極性的大孔樹脂（H-103、D-101、DM-130、AB-8、NKA-9、ADS-21）置于錐形瓶內，分別加入100 mL 吸附液后，置于恒溫振蕩器內，靜態吸附24 h 后過濾。通過下式計算不同類型大孔樹脂的靜態吸附量與吸附率[11]。

式中：Γe為樹脂的吸附量，mg/g；m0為吸附液中多酚質量，mg；me為吸附后濾液中多酚質量，mg；m為干燥的大孔樹脂質量，g；Qe為吸附率，%。

利用乙醇溶液作解吸劑，將吸附后的樹脂過濾，用一定量水洗至無提取液殘留后，置于錐形瓶內，加入70%乙醇100 mL 后，置于恒溫振蕩器中，靜態解吸24 h，過濾，測定濾液中多酚的含量，通過下式計算不同類型樹脂的解吸率與回收率[12]。

式中：Dd為解吸率（%）；md為解吸液中多酚質量（mg）；m0為原吸附液中多酚質量（mg）；me為吸附后濾液中多酚質量（mg）；R為回收率（%）。

1.2.5 不同吸附條件對樹脂動態吸附率的影響

以50 mL 乙醇為溶劑配制不同濃度的吸附液。根據預試驗結果，取5 g 已處理后的AB-8 大孔樹脂濕法裝柱后，分別考察上樣液濃度、上樣液pH 和上樣流速對樹脂的吸附率影響，具體如下：（1）當上樣液濃度0.3 mg/mL，上樣液pH 為4 時，上樣流速分別為：1、2、3、4、5 mL/min；（2）當上樣液濃度 0.3 mg/mL，上樣流速為 2 mL/min 時，上樣液 pH 分別為：2、3、4、5、6；（3）當上樣液pH 為4，上樣流速為2 mL/min 時，上樣液濃度分別為：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL。吸附完成后，測定流出液中多酚含量，計算樹脂吸附率。

1.2.6 不同洗脫條件對洗脫率的影響

以乙醇溶液作洗脫劑，分別考察洗脫液濃度、洗脫流速與洗脫液體積對多酚化合物洗脫率的影響，具體如下：（1）當洗脫流速為1 mL/min、洗脫液體積為100 mL 時，洗脫液濃度分別為 50%、60%、70%、80%、90%；（2）當洗脫液濃度為70%、洗脫流速為1 mL/min時，洗脫液體積分別為 80、90、100、110、120 mL；（3）當洗脫液濃度為70%、洗脫液體積為100 mL 時，洗脫流速分別為 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min。洗脫完成后，測定流出液中多酚含量，計算洗脫率（洗脫的多酚占被吸附的多酚的百分比）。

1.2.7 抗疲勞試驗

1.2.7.1 試驗設計

30 只健康雄性小鼠，隨機分為3 組，每組10 只，分別為對照組、提取組和純化組，向提取組和純化組的飼料內摻入等量的多酚提取物和純化物，每天喂食2 次，連續喂食30 d。每組小鼠每次喂食1 h 后于恒溫游泳池內開展游泳訓練，5 d 為一訓練周期，共訓練4周，空白對照組采用等量生理鹽水灌胃[13]。

1.2.7.2 小鼠負重游泳時間

第30 天，喂食結束1 h 后于鼠尾負重自身5%的重物，進行力竭性游泳試驗，記錄小鼠自入水開始游泳至沉沒超過10 s 的時間，即為游泳力竭時間[14]。

1.2.7.3 生化指標檢測

小鼠游泳運動進行10 min 后，取出擦凈，摘取眼球，抽血離心，收集血清，同時分取肝與肌肉組織，利用相關試劑盒，分別測定不同組別小鼠肝臟中肝糖原含量、肌肉中肌糖原含量和血清中乳酸濃度、丙二醛含量、尿素氮含量與乳酸脫氫酶活力。

1.2.8 數據處理

相關評價指標均采用均數、標準差描述，利用SPSS 19.0 進行方差分析，檢驗水準α=0.05，當P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01 表示具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的選擇

表1 為不同類型樹脂的靜態吸附與解吸性能比較。由表1 可見，弱極性樹脂對多酚化合物表現出較好的純化效果，特別是AB-8 大孔樹脂的靜態吸附回收率遠高于其他五類樹脂，達到80.47%，這歸因于多酚化學結構上的羥基具有一定的極性，使得AB-8 大孔樹脂能夠與其產生較好的吸附作用[15]，因此確定采用AB-8 作為純化短梗五加多酚的吸附樹脂。

表1 不同樹脂的靜態吸附與解吸性能比較Table 1 Comparison of static adsorption and desorption performance of different macroporous resins

AB-8 大孔樹脂的靜態吸附曲線如圖1 所示。隨著吸附時間的增長，AB-8 大孔樹脂對短梗五加多酚的吸附率不斷升高，在吸附6 h 后趨于平衡。

2.2 AB-8 純化效果的單因素試驗

2.2.1 上樣液濃度對短梗五加多酚吸附率的影響

上樣液濃度過高可能會造成吸附不完全，上樣液濃度過低，分離純化耗時會過長，影響試驗效率。不同上樣液濃度對短梗五加多酚吸附率的影響如圖2所示。隨著上樣液濃度的增大，AB-8 大孔樹脂對短梗五加多酚的吸附率緩慢降低；當上樣液濃度為0.4 mg/mL 時，吸附率明顯下降。綜合考慮，確定上樣液濃度以0.1 mg/mL 為宜。

2.2.2 上樣液pH 對短梗五加多酚吸附率的影響

不同上樣液的pH 對吸附率的影響如圖3 所示。隨著上樣液pH 的增大，AB-8 大孔樹脂對短梗五加多酚的吸附率先增高后降低，當pH 為4 時達到最大值，這源于短梗五加多酚的化學結構中含有酚羥基，呈弱酸性，而上樣液在弱酸性時可降低其溶解性從而易于吸附[16]。因此，確定上樣液pH 以4 為宜。

2.2.3 上樣流速對短梗五加多酚吸附率的影響

在動態吸附時，上樣流速過快，目標物與樹脂接觸不充分，可能造成過早泄漏；但流速過慢，又導致耗時過長，且對后續樹脂再生產生不良影響。不同上樣流速對吸附率的影響如圖4 所示。隨著上樣流速的增大，AB-8 大孔樹脂對短梗五加多酚的吸附率呈下降趨勢。綜合考慮吸附效率，本研究確定上樣流速2 mL/min 為宜。

2.2.4 洗脫液濃度對短梗五加多酚洗脫率的影響

不同濃度的乙醇對短梗五加多酚的洗脫效果如圖5 所示。隨著洗脫液濃度的增大，洗脫率逐漸增大；當洗脫液濃度為70%時，洗脫率開始下降。這可能是因為低濃度乙醇無法使得多酚類化合物充分溶出，洗脫不充分，而高濃度乙醇的極性與多酚相差較大，不利于洗脫[17]。因此確定洗脫液以70%的乙醇較為適宜。

2.2.5 洗脫流速對短梗五加多酚洗脫率的影響

不同洗脫流速對短梗五加多酚的洗脫率影響如圖6 所示。隨著洗脫流速的增大，洗脫率逐漸下降，這歸因于流速較快時，洗脫液不能充分接觸樹脂，但流速過低，又會延長洗脫過程。因此確定洗脫流速1.0 mL/min 較為適宜。

2.2.6 洗脫液體積對短梗五加多酚洗脫率的影響

不同洗脫液體積對短梗五加多酚的洗脫率影響如圖7 所示。當洗脫液用量達到100 mL 時，洗脫率趨于平衡，表明樹脂吸附的多酚基本被洗脫。因此確定洗脫液體積100 mL 較為適宜。

2.3 最佳工藝驗證

采取上述條件純化短梗五加提取物中多酚，即配制濃度為 0.1 mg/mL、pH = 4 的上樣液 50mL，以2 mL/min 流速上樣至5 g AB-8 型大孔樹脂中進行吸附。采用體積為100 mL、濃度70%的乙醇溶液，以1 mL/min 流速洗脫，測得吸附率為90.35%，洗脫率為89.87%。純化前后產物的多酚含量如表2 所示。產物的多酚含量由純化前的124.53 mg/g 提高至純化后的279.73 mg/g，約提高 2.25 倍。

2.4 不同組別小鼠的游泳力竭時間比較

負重游泳時間的長短直接反映運動過程的抗疲勞程度[18]。不同產物對小鼠的負重游泳時間影響如圖8 所示。由圖8 可知，與對照組相比，提取組與純化組小鼠的負重游泳時間均極顯著延長（P＜0.01），表明短梗五加多酚能夠提高小鼠的運動耐力；而純化組小鼠的游泳時間較提取組明顯增長，差異具有顯著性（P＜0.05），表明純化產物有助于更好地增強小鼠的運動耐力。

2.5 不同物質對小鼠的血乳酸濃度和乳酸脫氫酶活力的影響

身體運動后乳酸的濃度水平與疲勞程度呈正相關，機體高強度運動后會造成體內部分細胞缺氧，致使血糖發生糖酵解生成乳酸，蓄積在骨骼肌等組織中，而乳酸脫氫酶可迅速催化乳酸脫氫形成丙酮酸，有利于排泄出體外[19]。不同產物對運動后小鼠的體內乳酸生化指標影響見圖9。與對照組相比，提取組與純化組小鼠運動后血乳酸生成量明顯偏低，且體內乳酸脫氫酶活力極顯著增強（P＜0.01）；同時純化組小鼠體內的血乳酸含量和乳酸脫氫酶酶活力與提取組小鼠之間呈極顯著差異（P＜0.01），從而表明短梗五加多酚的純化產物具有良好的開發利用價值。

2.6 不同物質對小鼠的肝糖原和肌糖原含量的影響

肝糖原與肌糖原是機體的重要儲能物質，當機體開始運動時，肌糖原逐漸消耗至殆盡，隨后利用肝糖原以維持體內運動時血糖水平。由圖10 可以看出，提取組與純化組的兩種糖原含量均極顯著高于對照組（P＜0.01），而純化組體內的兩種糖原含量明顯更高，從而表明短梗五加純化產物有助于明顯增加體內肝糖原與肌糖原的儲備，進而更好地發揮抗疲勞作用。

2.7 不同物質對小鼠的尿素氮和丙二醛含量的影響

機體的劇烈運動會增加體內蛋白質的分解代謝，使得代謝產物尿素氮從腎臟經血液循環排出體外，相關研究已證明體內尿素氮含量與機體的疲勞程度呈正相關[20]。由圖11 可知，提取組和純化組動物運動時，體內尿素氮含量均極顯著低于對照組（P＜0.01）；同時，運動后肝臟生成的丙二醛具有細胞毒性，可使蛋白質與核酸產生交聯聚合[21]，而提取組和純化組小鼠的肝臟丙二醛濃度均極顯著低于對照組（P＜0.01）。綜上結果表明，短梗五加純化產物可有效降低運動時蛋白質的代謝和丙二醛的生成速率。

3 結論

本研究采用AB-8 大孔樹脂純化短梗五加提取物中的多酚，利用單因素試驗得到最佳純化工藝條件：配制濃度為0.1 mg/mL、pH=4 的上樣液50 mL，以2 mL/min 流速上樣至5 g AB-8 型大孔樹脂中進行吸附，采用70 %乙醇溶液100 mL，以1 mL/min流速洗脫，樹脂對多酚的吸附率和洗脫率分別為90.35%、89.87%。產物的多酚含量由純化前的124.53 mg/g 提高至純化后的279.73 mg/g，約提高2.25 倍。該工藝操作簡便、純化效率較高，且產物可顯著延長小鼠的游泳力竭時間，顯著增加體內肝糖原、肌糖原含量和乳酸脫氫酶活力，并有效降低尿素氮、丙二醛和乳酸濃度水平，從而具有較好的抗疲勞作用。本研究可為短梗五加多酚化合物的進一步開發提供參考。