油樟葉精油的提取、化學成分、抗氧化以及抗菌活性研究

尹 浩，王晨笑，岳 進 ，焦順山, ，王小紅，蔣磷蕾 ,*

（1.上海交通大學食品科學與工程系，上海 200240；2.上海交通大學陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240；3.農業(yè)農村部都市農業(yè)重點實驗室，上海 200240；4.四川宸煜林業(yè)開發(fā)有限責任公司，四川 宜賓 644000）

油樟（Cinnamomum longipaniculatum(Gamble) N.Chao ex H.W.Li）是樟科樟屬常綠喬木，特產于四川和陜西[1]。樟油是從油樟樹中提取出的揮發(fā)性植物精油，實際生產中以從樹葉中提取為主。油樟葉中的揮發(fā)油含量為3.8%～4.5%[2]，主要由萜類化合物組成，主要成分為1,8-桉葉素和松油醇[3]。油樟油是一種重要的化工原料，其廣泛應用于醫(yī)藥、食品等領域[4]。目前，對油樟油及其主要成分的研究主要集中在抑菌[5-6]、殺蟲[7]、消炎鎮(zhèn)痛[8-10]、抗氧化[11]和抗癌[12]等活性方面，對透皮滲透[13]、胃保護[14]、減少黏液分泌[15]等方面也有少量研究。

酶輔助提取是指通過酶的作用破壞細胞結構，使得被提取物從細胞中更易釋放而被提取，具有效率高、操作簡便和條件溫和等優(yōu)點[16]，目前被廣泛應用于生物活性物質的提取。同時蒸餾萃取法是指通過同時把樣品和有機溶劑加熱至沸騰，使得蒸餾和萃取過程同時進行，從而提高提取收率[17]，目前也被廣泛應用于食品分析、香精香料等領域[18]。超臨界流體萃取是指利用超臨界流體所具有的類似于氣體的強穿透力和類似于液體的密度和溶解性來進行萃取，其具有條件溫和、無毒無害和高效等優(yōu)點[19]。

目前樟油的工業(yè)生產主要使用傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾方法，收率為1.5%～2.0%，遠低于油樟葉中揮發(fā)油實際含量[20]，低產率嚴重制約著我國油樟產業(yè)的發(fā)展。目前對樟油提取的研究主要集中在對水蒸氣蒸餾等傳統(tǒng)提取方法的改進和提升。鄧梅等[21]用索氏提取法提取樟油，出油率可達2.06%；周誥均等[22]研究了不同的水蒸氣蒸餾方式對樟油收率的影響，發(fā)現水上蒸餾提取率最高，可達3.83%；Chen 等[23]將微波輔助水蒸氣蒸餾與溶劑萃取串聯(lián)使用，樟油收率可以達到3%以上。將酶輔助提取、同時蒸餾萃取、超臨界流體萃取等方法應用于油樟油的提取鮮有報道。本研究采用酶輔助溶劑萃取法（EASE）、酶輔助水蒸氣蒸餾法（EASD）、酶輔助同時蒸餾萃取法（EASDE）和超臨界流體萃取法（SFE）從油樟樹葉中提取樟油，對精油進行氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（GC-MS）分析，并對其清除DPPH 自由基活性和抗菌活性進行研究，以期為樟油產業(yè)的升級和樟油精深加工提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

油樟樹葉于2017 年12 月采于四川宜賓，自然晾干后備用。

大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為上海交通大學食品加工與包裝實驗室保存菌種。

纖維素酶（Cellulase），上海麥克林生化科技有限公司產品；石油醚（Petroleum ether），上海泰坦科技股份有限公司產品；正戊烷（n-pentane），阿拉丁試劑（上海）有限公司產品；無水乙醚（ethyl ether absolute）、無水硫酸鈉（sodium sulfate anhydrous）、無水乙醇（ethyl alcohol absolute），均為上海凌峰化學試劑有限公司產品；吐溫-80（tween-80），國藥集團化學試劑有限公司產品；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），Sigma-Aldrich 公司產品；以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

NW10VF 型超純水系統(tǒng)，JP-500C 型粉碎機，2875 型水浴鍋，Multiskan GO 型酶標儀，IMP180 微生物培養(yǎng)箱，420 型恒溫搖床，RE-52AA 型旋轉蒸發(fā)器，HA120-50-01 型超臨界二氧化碳萃取裝置，PL2002 型電子天平，7890A-5975C 型氣相色譜質譜聯(lián)用儀，ZNHW-Ⅱ型智能恒溫電熱套，DCW-4006 型低溫恒溫槽。

1.2 方法

1.2.1 樟油提取

將油樟葉于室溫下晾干至含水量低于5%，用粉碎機粉碎，過 20 目篩[24]。

1.2.1.1 酶輔助溶劑萃取

稱取200 g 油樟葉粉置于5 L 燒杯中，加入0.6%的纖維素酶（10 000 U/g）和2 000 mL 去離子水（料液比 1∶10（g/mL））[25]，45 ℃水浴 1 h，并不斷攪拌，使油樟葉充分酶解。過濾，濾液和濾渣分別以石油醚萃取3次[26]。合并有機溶劑，往里加入1 g 無水硫酸鈉靜置24 h 脫水，過濾后將濾液旋轉蒸發(fā)去除溶劑得到粗樟油，稱重后計算收率并置于冰箱保存?zhèn)溆肹22]。

油樟葉精油收率計算公式：

1.2.1.2 酶輔助水蒸氣蒸餾

稱取150 g 油樟葉粉置于3 L 圓底燒瓶中，加入0.6%纖維素酶（10 000 U/g）和 1 500 mL 去離子水（料液比 1∶10（g/mL）），45 ℃下水浴 1 h，并不斷攪拌，使油樟葉充分酶解。加熱使混合物沸騰，有餾出物滴下時開始計時，蒸餾2 h 后停止加熱，收集餾出物上層油狀液體，往里加入1 g 無水硫酸鈉靜置24 h 脫水得到粗樟油，稱重后計算收率并放入冰箱保存?zhèn)溆茫章视嬎愎酵稀?/p>

1.2.1.3 酶輔助同時蒸餾萃取

稱取150 g 油樟葉粉置于3 L 圓底燒瓶中，加入0.6%纖維素酶（10 000 U/g）和1 500 mL 去離子水（料液比 1∶10（g/mL）），45 ℃水浴 1 h，并不斷攪拌，使油樟葉充分酶解。以戊烷和乙醚（體積比1∶1.2）作溶劑[27]，35 ℃水浴加熱有機溶劑，等U 型管內開始有有機溶劑回流時，加熱混合物使其沸騰，同時蒸餾萃取2 h，試驗裝置如圖1 所示，收集有機相，往里加入1 g 無水硫酸鈉靜置24 h 脫水，過濾后將濾液旋轉蒸發(fā)去除溶劑得到粗樟油，稱重后計算收率并放入冰箱保存?zhèn)溆茫章视嬎愎酵稀?/p>

1.2.1.4 超臨界二氧化碳萃取

稱取200 g 油樟葉粉置于超臨界裝置萃取筒中，開啟加熱開關對萃取釜、分離釜I 和分離釜II 進行預熱，當達到設定溫度時，打開CO2閥門，啟動泵加壓，調節(jié)萃取釜壓強使其到達預定壓強，對油樟葉中樟油進行萃取，萃取約30 min 后從分離釜I 處已無法接到萃取物，萃取結束。試驗條件為萃取釜溫度40 ℃，分離釜I 和分離釜II 溫度均為60 ℃，萃取釜壓強10 MPa，分離釜I 和分離釜II 壓強均為5 MPa[24]。收集萃取物，稱重后計算收率并放入冰箱保存?zhèn)溆茫章视嬎愎酵稀?/p>

以上所有提取方法均重復3 次。

1.2.2 樟油成分分析

1.2.2.1 精油處理

將酶輔助溶劑萃取法、酶輔助水蒸氣蒸餾法和酶輔助同時蒸餾萃取法提取得到的油樟葉精油均用正己烷稀釋 100 倍，取 1 μL 進行 GC-MS 分析。

準確稱取50 mg 超臨界流體萃取得到的油樟葉精油于1.5 mL 進樣瓶中，加入正己烷和無水乙醇（體積比 1∶1）1 mL 振蕩使其溶解，0.22 μm 微孔濾膜過濾后，進行GC-MS 分析。

1.2.2.2 GC-MS 分析條件

色譜條件：色譜柱 DB-5 毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm），進樣量 1 μL，分流比 5∶1；程序升溫為 50 ℃保持 3 min，5 ℃/min 升溫至 240 ℃，20 ℃/min 升溫至300 ℃保持 5 min。

質譜條件：電子電離（Electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度 150 ℃，質量掃描范圍（m/z）33～500，掃描速率0.8 s/全程。

1.2.2.3 定性和定量分析

對4 種樟油進行GC-MS 聯(lián)用分析，采集得到的總離子流圖中各質譜圖，利用NIST 庫檢索，同時采用保留指數和參考文獻來輔助質譜檢索定性；定量分析結果依據總離子流色譜峰的峰面積歸一化法來計算各組分的相對含量。

用于測定保留指數的正構烷烴系列標準樣品為C8-C16，計算公式為：

式中：I為待測物的程序升溫保留指數；tn和tn+1分別為含n、n＋1 個碳的正構烷烴的保留時間；tx為待測物的保留時間。

1.2.3 樟油抗氧化活性的測定

參考叢贏等[9]的方法，略作改動。取DPPH·39.43 mg溶于1 000 mL 溶劑無水乙醇中（0.1 mmol/L），充分振搖使其完全溶解。配制不同濃度梯度的樟油無水乙醇溶液，濃度分別為 0.157、0.313、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mg/mL，以抗壞血酸作為陽性對照。分別取0.1 mL 樟油溶液與3.9 mL 上述DPPH·無水乙醇溶液混合，室溫下避光反應30 min，測定混合液在516 nm 的吸光值。以無水乙醇為空白樣，平行測定3次，結果取平均值。DPPH 自由基清除率按下式計算：

式中：A0為 DPPH·溶液吸光值；At為待測樣品與DPPH·反應tmin 后的吸光值。

1.2.4 樟油最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration, MIC）和最低殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration,MBC）測定

菌懸液的制備：將細菌菌種活化，制成菌懸液。采用平板計數法測細菌濃度，調至濃度104～105CFU/mL，備用。

將樟油以吐溫80 為乳化劑，滅菌的肉湯培養(yǎng)基為溶劑配制成64 μL/mL 的母液，用直徑0.22 μm 的無菌濾器過濾除掉配制過程中可能引入的雜菌[28]，以二倍稀釋法將其依次稀釋至 64、32、16、8、4、2、1、0.5 μL/mL。選取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為受試菌種，向試管中加入2 mL 不同濃度的樟油肉湯培養(yǎng)基溶液和 20 μL 菌懸液（104～105CFU/mL），37 ℃下160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，以未加入菌懸液的樟油肉湯培養(yǎng)基溶液作為對照組，測定在540 nm 處的吸光值A540nm。與對照組相比OD 值變化小于0.05[29]的培養(yǎng)基視為無細菌生長，其含有樟油的濃度即為最低抑菌濃度（MIC）[30]。

取樟油MIC 以上未見細菌生長的培養(yǎng)物每管各0.1 mL，采用預加菌液傾注平板法接種至營養(yǎng)瓊脂平板，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長狀況，沒有細菌生長的最低濃度即為最低殺菌濃度（MBC）[28]。

1.2.5 數據處理

采用SPSS 軟件對油樟葉精油的收率進行ANOVA方差分析，結果以平均值±標準差表示，采用Duncan’s法進行多組樣本間差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 樟油的收率和物理性質

由表1 可見，4 種提取方法的油樟葉精油收率有顯著性差異，EASDE 法的收率最高，達到3.70%，EASD和SFE 法次之，分別為3.00%和2.29%，EASE 法最低，只有1.36%。與EASD 法相比，EASDE 法多了萃取的環(huán)節(jié)，可以將水相中溶解的樟油提取出來，因而收率最高。而SFE 法由于萃取壓強較高，導致萃取出的低沸點物質減少，高沸點物質增加，無法將油樟葉中大量存在的低沸點單萜類物質萃取出來，所以樟油收率較低[24]。EASE 法的樟油收率最低，是萃取前對樣品進行過濾以及濾渣萃取不完全導致，單獨使用溶劑萃取并不適用于提取樟油。

表1 不同提取方法下油樟葉精油的收率及主要物理性能Table 1 The yield and physical properties of Cinnamomum longipaniculatum essential oils obtained by different extraction methods

從提取時間上看，EASE 法約需2 h，而EASD 和EASDE 法由于需要蒸餾，提取時間可達4 h 以上，是幾種方法中最耗時耗力的；SFE 法雖然樟油收率較低，但相比前幾種方法省去了酶解、蒸餾和去溶劑的操作，提取一次僅需30 min 左右，是4 種方法中效率最高的。

EASE 法提取的樟油為墨綠色油狀液體，墨綠色是葉綠素等綠色物質溶于有機溶劑被萃取所致，樟油具有樟葉特有的香氣，且1,8-桉葉素氣味明顯。EASD法得到的樟油為無色澄清油狀液體，樟葉香氣明顯，且氣味較純凈。EASDE 法提取的樟油同樣是澄清油狀液體，微黃，具備樟葉特有香氣，且1,8-桉葉素氣味明顯。SFE 法提取的樟油為棕紅色膏狀固體，60 ℃下可融化，散發(fā)出濃郁的樟葉香氣，并伴隨一些雜味。

2.2 樟油化學成分分析

按上述試驗條件對4 種方法提取出的油樟葉精油的化學成分進行測定分析，得到總離子流色譜圖，如圖2 所示。采用NIST 庫檢索質譜和保留指數結合的二維定性法，定性結果及相對含量見表2，其中相對百分含量由峰面積歸一化法計算所得。

表2 不同方法提取的油樟葉精油中化學成分的GC-MS 鑒定結果及各化合物的相對含量Table 2 Identification results and relative contents of main chemical components from essential oil of Cinnamomum longipaniculatum obtained by different extraction methods

續(xù)表2 不同方法提取的油樟葉精油中化學成分的GC-MS 鑒定結果及各化合物的相對含量Continue table 2 Identification results and relative contents of main chemical components from essential oil of Cinnamomum longipaniculatum obtained by different extraction methods

由表 2 可以看到，采用 EASE、EASD、EASDE、SFE 提取的樟油中萜類化合物較多，以單萜和倍半萜類為主。EASE 法所得揮發(fā)油共鑒定出37 種化合物，占精油總量的95.74%，其中有單萜類化合物20 種（54%），倍半萜類化合物16 種（43%），其他類化合物1 種（3%）。提取物的主要成分為1,8-桉葉素（53.38%）、α-松油醇（24.02%）、檜烯（5.37%）、4-萜烯醇（2.67%）、順-4-側柏醇（2.48%）和δ-松油醇（2.07%）。EASD 法所得揮發(fā)油共鑒定出54 種化合物，占精油總量的98.40%，其中有單萜類化合物24 種（44%），倍半萜類化合物28 種（52%），其他類化合物2 種（4%）。主要成分有 1,8-桉葉素（38.34%）、α-松油醇（16.76%）、檜烯（9.38%）、4-萜烯醇（6.08%）、α-蒎烯（4.86%）和β-蒎烯（3.77%）。

EASDE 法提取的揮發(fā)油共鑒定出26 種化合物，占精油總量的99.66%，其中有單萜類化合物20 種（77%），倍半萜類化合物6 種（23%）。主要成分有1,8-桉葉素（54.05%）、檜烯（9.95%）、α-蒎烯（7.82%）、γ-松油烯（6.22%）、β-蒎烯（5.80%）和 α-松油烯（4.46%）。

SFE 法提取的揮發(fā)油共鑒定出29 種化合物，僅占精油總量的53.69%，其中單萜類化合物12 種（41%），倍半萜類化合物15 種（52%），其他類化合物2 種（7%）。主要成分有 1,8-桉葉素（30.24%）、檜烯（5.71%）、石竹烯（4.46%）、α-松油醇（3.94%）。

從揮發(fā)油的成分和種類來看，4 種方法的提取物含有16 種共有成分，主要成分為1,8-桉葉素。酶輔助溶劑萃取（EASE）和酶輔助同時蒸餾萃取（EASDE）法提取的樟油1,8-桉葉素含量顯著高于其他兩種方法，分別為53.38%和54.05%；酶輔助溶劑萃取（EASE）法提取的樟油α-松油醇含量最高，達到24.02%。酶輔助溶劑萃取（EASE）、酶輔助水蒸氣蒸餾（EASD）和酶輔助同時蒸餾萃取（EASDE）法提取物成分相近，主要為單萜類化合物如蒎烯、檜烯、1,8-桉葉素和α-松油醇等。此外還含有多種倍半萜類化合物以及少量酯類化合物。而超臨界流體提取物中，單萜類化合物含量僅為43.74%，其中1,8-桉葉素的含量為30.24%。倍半萜類及其他高沸點化合物占大多數，所以提取物在常溫下為固態(tài)。

2.3 樟油抗氧化活性分析

DPPH 自由基是一種有機自由基，其結構中含有3 個苯環(huán)，1 個N 原子上有一個孤對電子，其乙醇溶液呈深紫紅色，并在515～529 nm 范圍內有最大吸收峰，當向DPPH 自由基溶液加入自由基清除劑后，其孤對電子被配對，紫紅色的DPPH 自由基被還原成淺黃色的DPPH-H 非自由基形式，且褪色程度與其接受的電子數成定量關系，因而可以用來表征待測物的抗氧化活性。4 種方法提取出油樟油的DPPH 自由基清除能力見圖3。

由圖3 可以看出，DPPH 自由基的清除率與濃度相關，隨著濃度增大，油樟油的DPPH·清除率均提高。4 種方法提取出的樟油的DPPH·清除率存在一定差異，超臨界流體萃取的樟油DPPH·清除率高于其他三種樟油，抗氧化活性最強，原因可能是其成分中含有較多的高沸點化合物，具備較強的自由基清除能力。酶輔助溶劑萃取次之，而酶輔助水蒸氣蒸餾和酶輔助同時蒸餾萃取法提取的樟油DPPH·清除率很低，幾乎不具備抗氧化性。與VC 陽性對照組相比，4種方法提取出的樟油在受試濃度下DPPH·清除率遠低于VC，可見樟油的抗氧化能力較弱。

2.4 樟油抗菌活性分析

表3 展示了4 種樟油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC 和MBC。酶輔助溶劑萃取、水蒸氣蒸餾和同時蒸餾萃取法提取得樟油的抗菌活性相近，3 種樟油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較強的抑菌活性（MIC=8 μL/mL），而在殺菌方面，三種樟油對大腸桿菌的MBC（8 μL/mL）要低于金黃色葡萄球菌的MBC（16 μL/mL），說明樟油殺滅金黃色葡萄球菌的能力比殺滅大腸桿菌的能力弱；而超臨界流體萃取的樟油抗菌性較差，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為32、16 μL/mL，最低殺菌濃度分別為64、32 μL/mL，原因是樟油中1,8-桉葉素和松油醇等具有抗菌性的物質含量較低。

表3 4 種樟油的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）Table 3 The MIC and MBC of four kinds of Cinnamomum longipaniculatum essential oils 單位：μL/mL

3 結論

本研究使用酶輔助溶劑萃取法、酶輔助水蒸氣蒸餾法、酶輔助同時蒸餾萃取法和超臨界流體萃取法從油樟樹葉中提取樟油，并結合GC-MS 分析了油樟油的主要成分。結果表明，酶輔助同時蒸餾萃取法的收率最高，達到了3.70%，與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾相比極大地提高了油樟精油的收率。不同提取方法對樟油成分的影響較大，但主成分均為1,8-桉葉素。酶輔助同時蒸餾萃取法和酶輔助溶劑萃取法提取物中1,8-桉葉素含量超過50%。

4 種提取法提取的樟油其DPPH·清除率均顯著低于VC，超臨界流體萃取提取的樟油DPPH·清除率最高；酶輔助溶劑萃取、酶輔助水蒸氣蒸餾和酶輔助同時蒸餾萃取提取的樟油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抗菌效果，但超臨界流體萃取提取的樟油對兩種菌的抗菌效果均較差。

綜上所述：酶輔助同時蒸餾萃取法最適用于油樟油的提取；油樟油可以作為一種天然抑菌物質，在食品、醫(yī)藥領域有廣泛的發(fā)展與應用潛力。