類風濕關節炎合并干眼病患者血清中差異蛋白的分析

李曉玲 武艷梅

(1錦州醫科大學，遼寧 錦州 121000；2錦州醫科大學附屬第三醫院)

類風濕關節炎(RA)是一種累及全身多系統的慢性進行性自身免疫性疾病，其主要臨床特征為滑膜關節的慢性炎癥性病變，并合并關節外多器官病癥〔1,2〕。干眼病(DED)是一種淚液和眼表疾病〔3〕，是RA最常見的眼部病癥，其在RA患者中發病率可達19%～31%〔4〕，并常因未能及時發現和得到有效治療導致RA合并DED患者失明，使患者的生活質量受到嚴重影響。因此，早期發現RA患者的眼部病變，對于患者的治療和預后非常重要。本研究通過非標記(Label-free)定量蛋白質組學技術篩選RA合并DED患者血清中差異蛋白，并分析其功能及參與RA合并DED發病的生物學過程，為尋找診斷RA合并DED的早期血清學標志物及進一步探討RA合并DED的發病機制提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2019年6月在錦州醫科大學附屬第三醫院風濕免疫科確診為單純RA患者20例作為對照組，男7例、女13例，平均年齡(54.5±5.39)歲；同時選取RA(病程1～20 年，平均10年)合并DED患者20例作為觀察組，男4例、女16例，平均年齡(56.8±4.92)歲。經統計，兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。該研究方案經過醫院倫理委員會討論通過，所有患者或其監護人對本研究知情，并簽署了知情同意書。

1.2入選標準 納入標準：RA診斷依據2010年美國風濕病學會(ACR)/歐洲抗風濕病聯盟(EULAR)關于RA新分類標準〔5〕；RA合并DED診斷依據2013年中華醫學會眼科學分會角膜病學組《干眼臨床診療專家共識(2013 年)》中提出的干眼診斷標準〔6〕。排除標準：高血壓、糖尿病及心、腦血管疾病等全身疾病者；患有其他自身免疫性疾病、急慢性感染，腫瘤病史、肝腎損害者；1年內有激素和免疫抑制劑等特殊用藥史者。

1.3主要試劑和儀器 聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)定量試劑盒購自碧云天生物技術公司，其余試劑均購自Bio-Rad公司。C18 Cartridge(SPEC18柱)、C18 上樣柱、C18分析柱、納升級液相色譜儀(EASY-nLC 1000)、Q Exactive質譜儀均購自Thermo Scientific公司，MaxQuant (版本號1.5.3.17)分析軟件購自德國的Max Planck 生物化學研究所，電泳系統(EPS200)和化學發光儀(Tanon 4600)全自動化學發光圖像分析系統均購自上海天能科技有限公司。

1.4蛋白的提取和酶解 采集所有患者空腹靜脈血3 ml，離心、分離血清。用Sartorius超濾管(10 kD)對血清樣本進行超濾濃縮后，加入SDT 裂解液：4%(W/V)十二烷基硫酸鈉(SDS)、100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.6)和0.1 mol/L的二硫蘇糖醇(DTT)，將樣品置沸水浴裂解 15 min；取出樣品，上離心機，14 000 r/min離心20 min，提取上清液中的蛋白；用BCA檢測法測定蛋白濃度；取100 μg蛋白，加入胰蛋白酶(1∶50)，用超濾輔助樣品制備(FASP)方法進行胰蛋白酶酶解；用C18 Cartridge對酶解后的肽段進行脫鹽后，凍干肽段；用40 μl 0.1%甲酸溶液復溶凍干后肽段，于光密度A280下測定肽段濃度。

1.5數據采集 采用液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)。取凍干后肽段2 μg，用40 μl 0.1%甲酸溶液復溶后，用納升級液相色譜儀(EASY-nLC1000)對肽段進行分離，色譜條件：采用C18-A2色譜柱(10 cm×75 μm，3 μm)，以0.1%甲酸水溶液(緩沖液A)-0.1%甲酸乙腈溶液(緩沖液B)為流動相，流速300 ml/min，柱溫55℃，進樣量4 μl。用Q-Exactive質譜儀對分離后的肽段進行分析，質譜條件：掃描方式為正離子和自動獲取數據模式，電壓2 100～2 400 V，一級掃描范圍為300～1 800 m/z、一級分辨率為70 000 at 200 m/z、自動獲取控制目標為1e6、最大駐留時間為50 ms、動態排除時間為60.0 s；采集多肽和多肽碎片質量電荷比的方法和條件：每次對肽段全掃描后，采集20個碎片圖譜，MS2激活類型為高能誘導碰撞解離方式(HCD)，其中隔離窗為2 m/z、二級質譜分辨率為17 500 at 200 m/z、碰撞能量為30 eV、底部填充劑為0.1%。

1.6蛋白的鑒定和定量分析 采用MaxQuant軟件對質譜數據進行分析，并對蛋白質進行鑒定和定量分析，其質譜分析原始數據為RAW文件，以倍數上調>2倍或下調<0.5倍，且P<0.05的標準篩選差異蛋白質。

1.7生物信息學分析 采用Blast 2GO軟件對差異蛋白質進行基因功能(GO)注釋，通過Fisher精確檢驗后，對差異蛋白質進行GO注釋的富集分析，用Cluster3.0軟件對差異蛋白質的表達量進行層次聚類分析。

2 結 果

2.1蛋白鑒定和定量分析結果 本研究共鑒定到蛋白345種，對照組297種，觀察組298種，兩組間共有320種蛋白發生重疊(圖1)。通過定量分析，以觀察組/對照組蛋白表達差異倍數上調>2倍或下調<0.5倍且P<0.05的篩選標準，共篩選出13種差異表達蛋白，其中上調蛋白9種、下調蛋白4種，見圖1、表1。

A：對照組；B：觀察組；橫坐標為差異倍數(以2為底的對數變換)，縱坐標為差異顯著性(以10為底的對數變換)，橫、縱坐標值距離 0 點越遠表示差異越大；紅色圈為差異表達蛋白(倍數大于2.0倍，且P<0.05)，黑色圈為無差異變化蛋白圖1 蛋白定量結果火山圖

表1 差異蛋白

2.2生物信息學分析結果

2.2.1差異蛋白GO功能的富集分析結果 篩選出來的13種差異蛋白主要參與多細胞生物過程、女性妊娠、外源凋亡信號通路的負調控、外源凋亡信號通路的調控和凋亡信號傳導通路負調控等重要的生物學過程(BP)，同時還參與細胞內非膜結合細胞器、超分子纖維、超分子復合物、非膜結合細胞器和超分子聚合物等細胞組分(CC)，并具有寡糖結合等分子功能(MF)，見圖2。

顏色梯度代表P值大小，條形圖上方是富集因子圖2 富集分析的差異蛋白前20位

2.2.2差異蛋白聚類分析結果 以倍數上調>2倍或下調<0.5倍，且P<0.05篩選標準得到的差異蛋白可有效地將兩組分開，表明本研究差異表達蛋白篩選的合理性和準確性，見圖3。

A：對照組；B：觀察組；橫坐標為樣本，縱坐標為差異蛋白；圖中每個小方格代表一種蛋白，紅色部分為上調蛋白、藍色部分為下調蛋白，表達量越多顏色越深；每行為每個蛋白在不同組中的表達量情況，每列為每個組中所有差異蛋白的表達量情況；上方樹形圖為觀察組和對照組數據的聚類分析結果，左側樹狀圖為不同蛋白數據的聚類分析結果 圖3 差異蛋白聚類分析結果樹形熱圖

3 討 論

非標記定量蛋白質組學技術是通過液相色譜-質譜聯用(HPLC-MS)技術對蛋白質酶解肽段進行質譜分析，比較不同樣品中相應肽段的信號強度，從而對肽段對應的蛋白進行相對定量，篩選目的蛋白，其近年來廣泛被用于差異蛋白的研究〔7，8〕。本研究共篩選出了13種差異蛋白，9種蛋白表現為上調、4種蛋白表現為下調。

PRDX2是一種重要的抗氧化劑，通過抗氧化活性參與細胞的炎癥和免疫反應，在免疫調節中充分發揮氧化還原酶的作用〔9〕。有研究表明，氧化損傷和炎癥反應共同參與了DED的發病，在實驗動物飼料中加入抗氧化劑后，則發現實驗動物眼表上皮細胞的氧化損傷減輕〔10〕。SAA是由肝細胞產生的一種急性時相蛋白，當機體發生炎癥感染或損傷時，其可迅速升高，如RA、糖尿病腎病等患者血清中SAA含量明顯升高，是診斷機體炎癥感染的一個靈敏指標〔11～14〕，有學者認為炎癥反應是各類型DED發病的共同機制〔15，16〕。SAA1是SAA家族中的一員，共有SAA的生物學特性。本研究結果表明RA合并DED患者體內存在氧化應激和炎癥反應，二者均可作為診斷RA合并DED的早期血清學標志物。

REG為免疫炎癥調節因子，在炎癥、腫瘤等多種疾病或受損組織中均有表達，具有促進細胞增殖、分化和抑制細胞凋亡的生物功能〔17〕，其高表達可引起自身免疫性疾病的發生，并促進病情的發展，因此又被認為是一種自身抗原〔18〕。 REG3α為REG 家族中一員，具有抗炎等保護作用〔19〕。補體因子(CF)H和CFHRP是補體系統激活途徑中的調節因子，CFH 在補體活化過程中起抑制作用，CFHRP通過與CFH競爭性結合補體 C3b，從而影響 CFH 對補體的抑制功能〔20，21〕。一些自身免疫性和炎癥性疾病的病理過程與補體的過度激活和抑制不足相關，如RA患者關節滑液中補體持續激活〔22〕。CFHRP3是CFH家族的一員，可通過與CFH競爭性結合C3b，促進補體的激活〔23，24〕。

本研究首次在RA合并DED患者血清中檢測到REG3α和CFHRP3，且均顯示為上調，我們將在后續的研究中驗證二者能否作為診斷RA合并DED的早期血清學標志物。Ig也稱抗體，是機體體液免疫應答時B細胞產生的重要免疫效應分子，在機體抵抗外來病原體中發揮著重要的作用。Ig由5條重鏈(H鏈，分為γ鏈、α鏈、μ鏈、δ鏈、ε鏈)和2條輕鏈(L鏈，分為κ型和λ型)組成，L鏈陽性或升高多見于多發性骨髓瘤、慢性淋巴細胞性白血病、巨球蛋白血癥、淀粉樣變性等〔25～27〕，H鏈升高多見淋巴細胞和漿細胞的惡性腫瘤〔28，29〕。研究發現，RA患者體內存在B細胞反應，產生抗瓜氨酸化蛋白抗體 (ACPA)等自身免疫抗體，參與RA的病理改變〔30，31〕；干燥綜合征、RA等自身免疫系統性疾病患者機體免疫系統出現異常，眼成為自身抗體攻擊的靶器官，淚腺被大量的淋巴細胞浸潤，腺體分泌功能障礙，從而導致嚴重的DED〔32〕。本研究結果表明這些Ig均可能參與了RA合并DED發病過程中的體液免疫反應，因處于不同的病理改變時期或B細胞分化的不同階段，故表現為上調或下調，在診斷RA合并DED時，可作為血清學參考標志物。

LP(a)為富含膽固醇的血漿脂蛋白，主要在肝臟中合成，通過誘導內皮細胞趨化因子 I-309 活性的增加，導致血管壁損傷和炎性反應〔33〕，同時Lp對于哺乳動物細胞外脂質的包裝、儲存、運輸和代謝起著重要作用，脂質是淚膜的關鍵組成部分，主要是維持角膜表面光滑并防止眼表淚液過分蒸發。本研究結果表明RA合并DED患者體內可能存在脂質代謝紊亂的生物過程，使淚膜脂質含量發生了變化，導致瞼板腺功能障礙，引起淚膜不穩定，而發生DED，所以LP(a)上調可作為診斷RA合并DED的一個血清學參考指標。妊娠區蛋白(PZP)是人血漿中一種大分子糖蛋白，與α-1巨球蛋白(α1M)、α-2巨球蛋白(α2M)及補體C3、C4、C5同屬于人類α巨球蛋白家族(αMS)，存在人腦脊液、關節滑液和血液中。PZP與α2M具有同源性，具有廣譜的蛋白酶抑制作用，在IL-6、成纖維細胞生長因子(FGF)、神經生長因子(NGF) 等細胞因子免疫應答反應和肝抗菌肽、瘦素等激素調節方面發揮著重要的作用〔34，35〕。本研究首次在RA合并DED患者血清中檢測到PZP，顯示為表達下調，其可能參與了RA合并DED發病過程，是否能作為診斷RA合并DED早期血清學標志物，兩作進一步的研究進行驗證。

血紅蛋白(Hb)是動物體內最重要的呼吸蛋白之一，主要在脊椎動物的紅細胞內表達，不僅具有儲存能量、維持滲透壓、抗菌和發揮類酚氧化酶活性等多種生物功能，同時在宿主抵抗病原體入侵、調控機體天然免疫應答過程中也發揮了重要作用〔36〕。正常人有3種血紅蛋白：HbA、HbF、HbA2，HbA為成人紅細胞中的主要血紅蛋白，分為HbA1、HbA2、HbF，其中HbA1是血紅蛋白在代謝過程中與葡萄糖相結合的產物，與血液中葡萄糖水平成正比，因此可間接反映機體糖代謝情況〔37〕。本研究發現，在RA合并DED患者血清中HbA1表達為下調，其是否與RA合并DED患者淚液滲透壓升高、角膜上皮細胞屏障遭到破壞、細胞活性降低等生物過程相關，能否作為診斷RA合并DED早期血清學標志物，將作進一步的研究。