木姜子和忍冬藤配伍乙醇提取物減輕哮喘小鼠氣道炎癥的效果

藍凰齊 張世田 唐漢慶 黃小珊 李克明 林起慶

(1廣西中醫藥大學基礎醫學院，廣西 南寧 530200；2右江民族醫學院)

哮喘是一種變態反應性疾病，氣道炎癥在哮喘發生發展進程中起著重要作用，哮喘發作期氣道高反應性和臨床癥狀表現突出，而在哮喘緩解期，臨床癥狀盡管得到一定程度的控制，但氣道炎癥如果沒有得到有效緩解或治療，最終會導致氣道重塑和不可逆肺功能損害〔1,2〕。哮喘屬于疑難雜癥，根治的難度較大，民族傳統醫藥中有些療法和藥物對哮喘此類疑難雜癥有較好的效果，木姜子和忍冬藤屬于壯族醫藥常用藥物，兩藥相伍民間用于減輕哮喘發作，對于木姜子和忍冬藤配伍用于哮喘治療，其起效機制是否通過減輕哮喘炎癥，抑制炎性細胞在肺組織浸潤從而緩解氣道平滑肌痙攣，尚未見報道。本研究通過建立哮喘小鼠模型，觀察針挑療法及木姜子和忍冬藤配伍對哮喘小鼠相關炎癥因子水平的影響，探討其起效機制，為針挑療法及木姜子和忍冬藤配伍的應用及促進其在民族醫藥領域的進一步交流提供基礎研究資料。

1 材料與方法

1.1實驗動物 70只健康清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體重18.56～23.22 g。由右江民族醫學院動物實驗中心提供(許可證編號:SCXK桂2017-0004)。實驗遵循動物倫理的有關準則。

1.2藥物與試劑

1.2.1藥物 木姜子購于廣西仁濟堂中藥飲片公司(批號151101)；忍冬藤購于廣西張益堂中藥飲片有限公司(批號1602092)；將木姜子和忍冬藤按照1∶1比例，放到適量 70%食用乙醇里浸泡1 w，旋轉蒸發儀旋轉蒸發，濃縮為濃度 100 mg/ml，灌胃時將濃度稀釋為 2 mg/ml。地塞米松購于廣東華南藥業集團有限公司(批號H44024469)。

1.2.2主要試劑 白細胞介素(IL)-4、IL-5、IL-10、免疫球蛋白(Ig)E、干擾素(IFN)-γ酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒及鋅指蛋白(GATA)-3蛋白檢測試劑盒(伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號分別為AK0017DEC27018、AK0017DEC27019、AK00-17DEC27023、AK0017DEC27026、AK0017DEC270-32、UB1702311)；OVA(Solarbio公司，批號1218B-031)；氫氧化鋁(Thermo公司，批號SG252318)。

1.3儀器 DU530型紫外分光光度儀(美國Beckman公司)；MK3型酶標儀(美國Thermo Labsystem 公司)；PowerPac HC 型電泳儀、chemidoc XRS型凝膠成像系統(美國伯樂)； 402B型超聲霧化器(上海魚躍醫療設備有限公司)；RM2245型切片機(徠卡顯微系統(上海)有限公司)。

1.4動物分組、造模及給藥處理 小鼠隨機分為空白組、模型組、木姜子和忍冬藤配伍低、中、高劑量組(低、中、高劑量組)、針挑療法組(針挑組)、地塞米松陽性對照組(陽性組)7組，每組10只。參考文獻〔3〕造模方法。除空白組外，其他各組分別在實驗第1、8天腹腔注射卵清蛋白(OVA)致敏液0.5 ml/只(含5 mg OVA和15 mg氫氧化鋁)。第15天開始，將小鼠放入30 cm×30 cm×30 cm自制透明霧化箱中，每日通過霧化管向箱中噴入1 % OVA 30 min，霧量控制為0.5 ml/min，連續7 d。在霧化激發的同時，將小鼠置于溫度為-4～4℃的寒冷環境中，空調冷風吹襲，每日30 min，連續7 d。空白組的致敏液和激發所有試劑以生理鹽水代替。造模過程中，進行小鼠行為學觀察。造模小鼠在OVA溶液激發后開始表現為煩躁不安，活動頻繁，繼而呼吸急促，嚴重者縮胸、伸頸、收腹、大小便失禁，并隨著霧化和寒冷刺激天數的增加，小鼠飲食減少、毛色無光澤、行動遲緩及體重逐漸下降，并在喘息表現基礎上出現惡寒、扎堆少動，四肢不溫，弓背毛聳、噴嚏、流清涕、唇周發白等癥狀，而治療干預各組上述癥狀相對較輕，依據相關文獻報道〔4〕，表明造模成功。

自激發第8天起，低、中、高劑量組每天分別給予5、10、20 mg/kg木姜子和忍冬藤的乙醇提取物灌胃，陽性組給予地塞米松10 mg/(kg·d)；空白組和模型組給予等量的生理鹽水。針挑組選取定喘、肺俞、大椎、風門、腎俞、脾俞穴位，用三棱針挑出皮下部分纖維組織。每天1次，7 d為1個療程，治療1個療程。療程結束后取材檢測指標。

1.5指標檢測

1.5.1炎癥因子指標檢測 各組小鼠末次激發24 h后，用10%水合氯醛(無菌生理鹽水稀釋)腹腔注射麻醉，心臟取血，立即注入含有40 μl肝素的抗凝管中，2 000 r/min離心15 min，保存于-80℃冰箱中備測炎癥因子IL-4、IL-5、IL-10、IgE、IFN-γ，采用ELISA檢測，按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.2GATA-3蛋白檢測 取右肺組織，勻漿，提取蛋白，Western印跡檢測，按照試劑盒說明書進行操作。將條帶截圖，用 ImageJ 軟件分析條帶的灰度值。目的蛋白的灰度值與內參蛋白的灰度值比值即為目的蛋白的相對表達量。

1.5.3肺功能檢測 末次治療干預結束后1 h，10%的水合氯醛麻醉小鼠后，將小鼠仰臥固定于鼠臺上，用剪切開頸部皮膚并暴露氣管，以第2、3 環狀軟骨為標志做橫行切口，插入膠管行氣管插管，用絲線結扎、將小鼠置于肺功能儀體描箱內并連接動物呼吸機實施機械通氣。進行第0.1秒用力呼氣末容積(FEV0.1)、第0.2秒用力呼氣末容積(FEV0.2)、第0.4秒用力呼氣末容積占用力肺活量比值(FEV0.4/FVC)、呼氣峰流速(PEF)的肺功能指標檢測。

1.5.4肺組織形態學觀察 切取左肺組織用0.9%氯化鈉注射液洗凈，10%甲醛固定，常規脫水，制作蠟塊，切片后進行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.6統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件進行單因素方差分析及LSD-q檢驗。

2 結 果

2.1各組炎癥因子指標水平比較 和空白組比較，模型組血清IgE、IL-4、IL-5、IL-10水平升高而IFN-γ 水平降低，差異均有統計學意義(P<0.01或P<0.05)；和模型組比較，針挑組、陽性組和各劑量組血清IgE、IL-4、IL-5、IL-10水平降低而IFN-γ水平升高，差異均有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。見表1。

表1 各組IgE、 IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ水平比較

2.2各組肺功能比較 和空白組比較，模型組FEV0.1、FEV0.2、FEV0.4/FVC、PEF的肺功能指標明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。和模型組比較，針挑組、陽性組和各劑量組均能改善肺功能，差異均有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。見表2。

2.3GATA-3蛋白表達檢測結果 和空白組比較，模型組GATA-3蛋白表達升高；和模型組比較，針挑組、陽性組和各劑量組均能糾正GATA-3蛋白過高表達(P<0.01,P<0.05)。見表2，圖1。

表2 各組肺功能及GATA-3蛋白表達比較

M：Marker；1～7：模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽性組、針挑組、空白組圖1 GATA-3蛋白表達電泳

2.4各組小鼠肺組織形態學觀察 空白組支氣管、肺組織清晰，管壁光滑，無血管充血及炎癥細胞浸潤；模型組支氣管、肺組織結構不清、管壁不光滑、有大片炎癥細胞浸潤；針挑組、陽性組和各劑量組肺泡間隔增厚不明顯，肺泡滲出物較少，黏膜下及肺間質炎癥細胞浸潤程度也較輕，較模型組有明顯改善。見圖2。

圖2 各組肺組織形態學(HE,×200)

3 討 論

哮喘發生發展中的氣道高反應性一直受到關注，其機制研究不斷深入，炎癥反應起到重要作用，氣管和肺組織的嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤導致黏液分泌和氣道高反應性，長期處于此種情況，將會進一步導致氣道重塑不可逆性增加，使哮喘的治療變得更困難，這也是中醫學將“喘”列為疑難雜癥之一的原因。有醫學研究表明，在哮喘中，Th2型細胞炎癥因子如IL-4、IL-5、IL-10等存在水平上升而Th1型細胞因子如IFN-γ水平下降的現象〔5〕，其中IL-4作為炎癥介質，刺激B細胞分泌IgE，促進嗜酸性粒細胞的增殖和聚集，引起炎癥的反應擴大，加重了氣道高反應性并促進其進展。促炎因子IL-5或IL-10可刺激嗜酸性粒細胞的分化〔6〕，Th2型細胞炎癥因子的優勢表達是哮喘發生發展炎癥反應持續的重要原因。IFN-γ作為Th1型代表性細胞因子，已有研究表明其在加強機體免疫功能方面的重大作用，而且IFN-γ/IL-4的水平可反映Th1/Th2平衡，提高IFN-γ水平或降低IL-4水平可控制哮喘的炎癥反應〔7〕，Th2型細胞炎癥因子的優勢表達需要轉錄因子的參與刺激，GATA-3作為Th2型細胞炎癥因子分泌的特異性轉錄因子已得到廣泛認同，其高表達刺激Th2型細胞炎癥因子的分泌，考慮通過調節轉錄因子表達從而控制哮喘炎癥反應成為一種思路。

壯醫針挑療法是在壯醫理論指導下的臨床外治技法，是壯族醫藥的一種特色療法，一般采用消毒大號縫衣針根據不同疾病選取不同穴位作為挑刺點，挑出皮下一些纖維組織，具有所需器械簡單及操作易學的優點，對哮喘有較好的緩解作用，作為一種哮喘治療和肺康復的物理治療手段，在哮喘及肺康復具有較好的臨床應用價值，近年來受到關注和肯定。壯醫藥理論一般認為其通過調節“谷道”、“水道”、“氣道”、“龍路”、“火路”五條道路(即“三道兩路”)起效〔8〕。本研究針挑組選取定喘、肺俞、大椎、風門、腎俞、脾俞穴位，起到疏通氣道，同時對“谷道”、“水道”、“龍路”、“火路”也起到良性的刺激作用。木姜子和忍冬藤是常用的壯藥，民間傳統上將木姜子和忍冬藤等量配伍，再用小鍋米酒進行浸泡，當作保健滋補酒適量飲用，對哮喘有一定的緩解作用，相當于民間經驗方，在壯族民間用于哮喘的治療。其中木姜子具有止咳平喘、解痙鎮攣、補虛強身作用，現代藥理學認為其具有抗炎〔9〕、提高免疫功能作用〔10〕。忍冬藤有清熱解毒、疏風通絡作用，現代藥理學認為其具有抗炎〔11〕、抗氧化〔12〕、提高免疫功能〔13〕、舒張平滑肌作用〔14,15〕。本實驗工作采用木姜子和忍冬藤配伍治療哮喘，通過檢測相關炎癥因子指標，觀察其起效機制，從而為其在中醫藥(民族醫藥)領域的交流和應用提供基礎研究依據。本研究結果與近來報道〔16〕一致，提示針挑療法、木姜子和忍冬藤配伍治療哮喘，能夠調節GATA-3表達，通過減輕哮喘炎癥，抑制炎性細胞在肺組織的浸潤從而改善肺功能而起效，但對于其調節GATA-3表達的更上游機制，仍需要下一步的研究。