當(dāng)歸紅芪超濾物對輻射致新生大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性因子的影響

劉旭幫 張朝華 孫丹丹 趙信科

(1鄭州人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450000，2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科)

放射性心臟疾病一般是指心臟受到放射性物質(zhì)輻射后而發(fā)生的一類損傷性病變，隨著放射性治療在惡性腫瘤中的廣泛應(yīng)用，放射性心臟疾病的臨床報告逐漸增多，患者主要臨床表現(xiàn)為心律失常、心包炎、心肌纖維化及心肌梗死等，目前仍無有效的治療手段，給患者的身心健康造成極大影響〔1,2〕。隨著中醫(yī)臨床研究的不斷發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸、紅芪等中藥具有抗氧化損傷及抗輻射等作用〔3,4〕，本研究通過觀察當(dāng)歸紅芪超濾物對輻射后乳鼠心肌組織氧化應(yīng)激和炎性因子相關(guān)指標(biāo)的影響，為放射性心臟疾病的發(fā)生機(jī)制及中醫(yī)治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 選擇1～3日齡的Wistar大鼠10只作為實(shí)驗(yàn)動物，雌雄不限，體重6～10 g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物 當(dāng)歸紅芪超濾物的制備過程〔5〕：當(dāng)歸和紅芪飲片按照1∶5的比例進(jìn)行混合，水煎煮3次后，過濾雜質(zhì)并加熱濃縮，冷卻至室溫后使用陶瓷膜微濾當(dāng)歸紅芪水煎劑濃縮液，具體技術(shù)參數(shù)：壓力0.5 kPa/m3、溫度25 ℃、流量100 L/(h·m3)，選用截留相對分子量為1×105PNA的中空纖維超濾膜對微濾后的濃縮液進(jìn)行超濾處理，具體技術(shù)參數(shù)：膜面積0.25 m2、系統(tǒng)壓力≤5.0 bar、過濾能力 2～30 L/h，最后將濃縮超濾液噴霧干燥成粉末，分裝置于干燥器中備用。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 無菌條件下取Wistar大鼠心尖部組織，使用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，將心肌組織剪成約1 mm3大小后移入離心管中，加入0.08%胰蛋白液進(jìn)行反復(fù)吹打，動作要輕柔，然后置于37℃水浴消化10 min，棄去上清液，再加入0.08%胰蛋白液和0.05%膠原酶，反復(fù)吹打后置于37℃水浴消化8 min，取上清液移入新離心管中，加入等體積含15%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，將混合液以1 500 r/min離心10 min后棄去上清液，加入培養(yǎng)液混懸細(xì)胞沉淀，放置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 空白組常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)48 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；模型組常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)48 h后換液，采用6 MV-X線垂直照射，放射野為30 cm×30 cm，靶區(qū)照射劑量DT為200 cGy，以6 Gy作用心肌細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；干預(yù)組根據(jù)當(dāng)歸紅芪超濾物濃度的不同，分別加入含3 mg/ml(低劑量干預(yù)組)、6 mg/ml(中劑量干預(yù)組)和9 mg/ml(高劑量干預(yù)組)當(dāng)歸紅芪超濾物至培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后換液，采用同模型組相同的X線進(jìn)行照射，使用加入上述濃度當(dāng)歸紅芪超濾物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1細(xì)胞活性檢測 將心肌細(xì)胞以1×105個/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，100 μl/孔，各組經(jīng)過相應(yīng)處理后，每孔加入100 μl 噻唑藍(lán)(MTT)于37 ℃孵育4 h后，棄去培養(yǎng)液，然后每孔再加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，充分振蕩使結(jié)晶物溶解。選擇570 nm 波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值(OD值)，計(jì)算生長抑制率 =(空白組 OD值-待檢測組OD值)/ 空白組OD值 ×100%

1.3.2氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 各組心肌細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理后，黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶(SOD)含量，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛(MDA)含量，2,4-二硝基苯肼顯色法檢測乳酸脫氫酶(LDH)含量，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，并通過分光光度計(jì)比色法進(jìn)行檢測。

1.3.3炎性因子指標(biāo)檢測 各組心肌細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理后，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β水平，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1當(dāng)歸紅芪超濾物對輻射致心肌細(xì)胞生長抑制率的影響 模型組OD值顯著低于空白組(P<0.05)，說明模型組心肌細(xì)胞存活數(shù)量明顯減少；各干預(yù)組心肌細(xì)胞生長抑制率均顯著低于模型組(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 當(dāng)歸紅芪超濾物對輻射致心肌細(xì)胞生長抑制率的影響

2.2當(dāng)歸紅芪超濾物對輻射致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 模型組心肌細(xì)胞SOD含量低于空白組，MDA和LDH含量高于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各干預(yù)組心肌細(xì)胞SOD含量均高于模型組，MDA和LDH含量均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表2。

表2 當(dāng)歸紅芪超濾物對輻射致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

2.3當(dāng)歸紅芪超濾物對輻射致心肌細(xì)胞炎性因子的影響 模型組心肌細(xì)胞TNF-α和IL-1β含量均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各干預(yù)組心肌細(xì)胞TNF-α和IL-1β含量均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P均<0.05)。見表3。

表3 當(dāng)歸紅芪超濾物對輻射致心肌細(xì)胞炎性因子的影響

3 討 論

放療作為腫瘤疾病治療的主要手段之一，既可與手術(shù)、化療等聯(lián)合使用，也可單獨(dú)使用，近年來放療技術(shù)發(fā)展十分迅速，但是臨床表明，放療會導(dǎo)致患者心臟受到輻射損傷，增加心律失常、心包炎、心肌纖維化及心肌梗死等放射性心臟疾病的發(fā)生率〔6〕。放射性心臟疾病的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，可能與放射性直接損傷心肌細(xì)胞、血管及淋巴管等有關(guān)，因此明確疾病的發(fā)生機(jī)制對于改善預(yù)后具有重要意義〔7〕。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組心肌細(xì)胞SOD含量明顯低于空白組，MDA、LDH及TNF-α和IL-1β含量均明顯高于空白組，說明新生大鼠心肌細(xì)胞在受到輻射后，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)失衡致使氧自由基大量蓄積，產(chǎn)生過氧化作用，造成心肌細(xì)胞膜、核酸及蛋白質(zhì)等生物大分子氧化損傷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞形態(tài)、功能發(fā)生異常〔8,9〕，并且心肌還會產(chǎn)生促炎趨化因子，刺激TNF-α和IL-1β等炎性細(xì)胞因子合成，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞大量滲出，發(fā)生局部炎癥反應(yīng)，造成心臟微血管損傷及心肌細(xì)胞壞死等，誘發(fā)放射性心臟病〔10,11〕。

中醫(yī)理論認(rèn)為，輻射損傷屬于熱毒蘊(yùn)結(jié)所致脾腎虛化和氣血津液運(yùn)行失常，因此應(yīng)以益氣補(bǔ)血、化瘀通脈的治療為主，并兼顧提高免疫力、抗氧化應(yīng)激以及抗輻射的中醫(yī)治療〔12〕。當(dāng)歸紅芪超濾物是來源于當(dāng)歸補(bǔ)血湯，主要成分為當(dāng)歸和紅芪中藥，其中當(dāng)歸補(bǔ)血活血、通經(jīng)活絡(luò)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，當(dāng)歸具有抗癌作用，用于化療后正氣虛弱的患者，可扶正抗癌，并具有抗氧化作用，可通過直接消除自由基，抑制氧化反應(yīng)和自由基反應(yīng)，減輕心臟組織的損害〔13〕；紅芪可補(bǔ)氣固表，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅芪具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗炎和抗氧化作用，并可擴(kuò)張冠狀動脈，改善心肌供血，增強(qiáng)心肌收縮力〔14〕。李應(yīng)東等〔15〕研究表明，歸紅芪超濾物可提高大鼠心肌組織中的SOD和谷胱甘肽-過氧化物酶的活性，并降低MDA含量，進(jìn)而發(fā)揮抗衰老作用；陳雪娟等〔16〕研究表明，當(dāng)歸紅芪超濾物可通過降低心肌梗死大鼠LDH和LDH 同工酶活性，發(fā)揮抗心肌缺血損傷作用，有效保護(hù)大鼠心肌組織。本研究結(jié)果說明當(dāng)歸紅芪超濾物可有效減輕輻射致新生大鼠心肌細(xì)胞的氧化損傷和免疫反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞，表現(xiàn)為各干預(yù)組心肌細(xì)胞生長抑制率明顯低于模型組，同時本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸紅芪超濾物對于心肌細(xì)胞生長抑制率、氧化應(yīng)激及炎性因子指標(biāo)放入改善呈現(xiàn)明顯地劑量依賴性，說明用藥劑量與心肌保護(hù)作用存在密切關(guān)系。

綜上所述，當(dāng)歸紅芪超濾物可有效改善輻射致新生大鼠心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激及炎性因子指標(biāo)，避免心肌細(xì)胞受損，并與劑量存在密切關(guān)系。