豁痰通絡方對大鼠球囊損傷后內膜增生的干預機制

沈娟娟 褚穎 蘇穎 鄧悅 路方平 馬金玲 于克英

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是中老年多發病，現代醫學認為，動脈管壁逐漸增厚、變硬并且失去其彈性，動脈管腔逐漸縮小變細，是動脈粥樣硬化的主要病理特點。而病變的內膜不斷累積脂質及復合糖類，形成纖維組織增生，導致形成斑塊阻塞動脈，動脈進一步狹窄，影響血液循環，造成心肌組織缺血缺氧〔1〕，影響中老年人的健康及生活質量。血管重建術是現階段治療冠心病介入的重要手段。其優點包括應用簡便、術后安全、療效有效、術后創傷小，臨床適用范圍廣等。已成為治療冠心病廣泛應用的技術。然而術后易形成血管再狹窄，且復發率高，出現術后再狹窄的比率高達30%以上，這也成為該領域的難點〔2〕。血管再狹窄的主要病理機制與血管內膜增生呈正相關。本研究探討豁痰通絡方對大鼠球囊損傷后內膜增生的干預機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 ①實驗動物：北京維通利華實驗動物技術有限公司提供SPF級雄性大鼠60只，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001。②實驗試劑：豁痰通絡方，長春中醫藥大學提供，生藥含量：2.33 g/ml。辛伐他汀片，遠大醫藥中國有限公司，批號：H20000107。低分子肝素鈉注射液，杭州九源基因工程有限公司；顯影定影試劑盒，Santa Cruz公司。

1.2制備模型 SD大鼠術前皮注低分子肝素鈉抗凝1 h后進行造模〔3〕。大鼠麻醉后左頸總動脈進行球囊損傷術，并給予青霉素皮下注射抗炎，低分子肝素鈉皮下注射抗凝。假手術組大鼠僅分離結扎。

1.3實驗分組 SD大鼠隨機分為6組，其中假手術組、模型組給予蒸餾水灌胃，豁痰通絡方組給予1.633 g/ml灌胃；辛伐他汀組方給予0.119 mg/ml灌胃；豁痰通絡方+辛伐他汀組給予中藥組方1.633 g/ml、辛伐他汀0.119 mg/ml灌胃，術后次日灌胃給藥，連續7 d。以上所有藥物均按1 ml/kg體重配制給藥。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色法檢測大鼠頸動脈內膜增生 常規脫蠟、染色、脫水、封片，制備石蠟切片。HE分析：藍色染色見細胞核，淡紅色染色見細胞質，觀察內膜面積增生情況。

1.5免疫組化染色法 根據免疫組化試劑盒說明常規操作。核因子(NF)-κB 抗體效價1∶100免疫組化圖像分析：棕黃色染色為陽性反應。NF-κB在胞質和胞核表達。

1.6Western印跡實驗 取凍存于液氮的血管標本，總蛋白提取后采用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒測定濃度，配制10%分離膠，5%濃縮膠，設置恒壓80 V，30 min后將電壓設置為120 V(恒壓)，90 min結束電泳。轉膜設置恒定電流 400 mA，轉膜 90 min。采用脫脂奶粉進行室溫封閉 120 min，加入一抗，IκBα、NF-κB p65 25℃水浴箱中震蕩孵育1 h后4℃過夜。二抗孵育25℃水浴箱中2 h。應用Quantityone凝膠圖像分析計算積分光密度，以IκBα、NF-κB p65蛋白與內參照β-actin蛋白積分光密度的比值分別表示IkBα、NF-κB p65蛋白的相對含量。

1.7統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1HE染色法檢測大鼠頸動脈變化 假手術組內膜彈力正常，可見單層內皮細胞；模型組平滑肌細胞排列紊亂且可見增厚的內膜，橫切管腔可見向心性或偏心性狹窄，表明模型形成。與模型組比較，豁痰通絡方組、辛伐他汀組、豁痰通絡方+辛伐他汀組，內膜增生情況已見明顯緩解。見圖1。

圖1 各組頸動脈內膜增生情況(HE，×100)

2.2免疫組化染色法檢測大鼠頸動脈NF-κB的表達 模型組胞核呈棕黃色，并見棕黃色沉積顆粒為陽性反應。假手術組無陽性著色?；硖低ńj方組、辛伐他汀組與模型組比較陽性著色減少，豁痰通絡方+辛伐他汀組與模型組比較陽性著色明顯改善。見圖2。

圖2 各組頸動脈NF-κB蛋白表達(DAB，×400)

2.3Western印跡法檢測大鼠頸動脈 IκB-α蛋白的表達 比較模型組，豁痰通絡方組、辛伐他汀組、豁痰通絡方+辛伐他汀組均能夠極顯著降低p-IκB-α的蛋白表達量(P<0.05)，極顯著增加IκB-α蛋白的表達量(P<0.01)。見表1，圖3。

表1 各組大鼠頸靜脈組織p-IκB-α、IκB-α、p-p65和p-p65蛋白表達

1.假手術組；2.模型組；3.豁痰通絡組；4.辛伐他汀組；5.豁痰通絡+辛伐他汀組；下圖同圖3 Western印跡檢測p-IκB-α的蛋白表達

2.4Western印跡法檢測大鼠頸動脈 NF-κB p65蛋白的表達 比較模型組，豁痰通絡方組、辛伐他汀組、豁痰通絡方+辛伐他汀組均能夠顯著降低p-p65的蛋白表達量(P<0.05)，極顯著增加 p65 蛋白的表達量(P<0.01)。見表1，圖4。

圖4 Western印跡檢測p-p65的蛋白表達

3 討 論

3.1中醫經典理論對“心”及“血脈”的闡釋 《素問·靈蘭秘典論》曰：“心者，君主之官，神明出焉”〔4〕。心，生命活動的主宰，權重可比君主，心的主要的生理功能包括：主人的精神意識思維活動，主血脈?！端貑枴ち澆叵笳摗吩弧靶恼呱?，神之變也；其華在面，其充在血脈；為陽中之太陽，通于夏氣”〔4〕。不但闡明了心的主要的生理功能，亦以心為核心，以“四時五藏陰陽”為整體觀，論述了心與自然陰陽變化及人體形體官竅的對應關系?！端貑枴っ}要精微論》曰：“夫脈者血之府也”〔4〕?！鹅`樞·決氣》 曰：“何謂血？岐伯曰：中焦受氣取汁，變化而赤，是謂血。何謂脈？岐伯曰：塞遏營氣，令無所避，是謂脈”〔4〕。闡明氣血在脈道中運行，脈道是氣血運行的通道，脈道能約束營血的運行，令其不妄行于外。而氣血是人體內貯藏于臟腑間的精微物質，可以濡養機體，是人體一切生命活動的物質基礎。然《素問·靈蘭秘典論》曰：“主不明則十二官危，使道閉塞而不通，形乃大傷”〔4〕。若心的功能失常，則影響其他臟腑不安，使其相互聯系的道路閉塞不通，影響氣血的正常運行，氣血運行失常，氣機失調，陰陽失和，形體受到極大的損傷。故心藏神，主血脈，血脈病變，亦以論心、治心為所倚重。

3.2中醫理論對血管重建術后再狹窄的認識 中醫學認識人體與疾病的關系亦是從“天人相應”、“人體為有機相互聯系統一的整體”這一整體觀思想出發〔5〕。《素問·經脈別論》曰：“生病起于過用”〔4〕。言明無論是自然界外來氣候、情志變化、日常飲食及勞逸超過人體承受的常度后，均影響人體陰陽失調，臟腑經脈氣血運行失常，氣機失和，導致人體發生疾病。

人食水谷五味，飲食沒有節制或節律，過度偏嗜一味，導致相應藏氣偏盛，人體五臟貯藏氣血津液，日久影響五臟功能。例如《內經》中言：“飲食自倍，腸胃乃傷”〔4〕?！案吡褐?，足生大丁”〔4〕。 也就是說過食肥甘厚味之品，容易助濕生熱，濕熱互結，影響人體脾胃的生理功能，脾失運化，脾氣不升，不能化氣行水，聚水成痰，痰濁阻遏陽氣循行，氣血失和，壅阻于心脈發為胸痹。

大多數患者在血管重建術后均存在精神緊張甚至抑郁，中醫學認為情志由五臟產生，如果感受外界刺激，情志失于調攝，可反作用于人體五臟。例如，過度憂思竭慮易傷及脾臟，影響脾的生理功能，失于運化水谷及水液，氣機壅滯，水液內停，形成痰濕〔6〕。以及肝氣失于疏泄，肝氣上逆，氣機壅塞，郁而化火，灼津成痰。且肝氣郁結，持久不愈，木郁乘脾土，亦能影響脾的功能。脾胃為后天之本，氣血化生之源，若傷及脾胃，則脾土無力統攝，失于運化，津液停聚，聚而成痰，形成痰瘀互結，瘀阻心脈〔7〕。形成了氣滯、血瘀、痰濁、熱毒，四者又互為因果，久留不去，伏藏與人體臟腑中，若有內外因素干擾，必至血脈再次瘀阻。

3.3現代醫學對血管重建術后再狹窄的認識 血管再狹窄是指已經狹窄的血管經血管重建術后再次出現新生的狹窄，這是由于多種細胞及生長因子介導的血管修復性反應〔8〕，而其影響因素比較復雜。

血管再狹窄的基礎和關鍵環節在于成纖維細胞生長因子刺激血管平滑肌細胞，血管平滑肌細胞受到刺激后，進一步遷移并增殖，并向血管內膜下遷移〔9〕。同時改變了血管平滑肌細胞表型，也損傷了內皮細胞的功能。例如，在治療血管狹窄時，機械性擴張會影響血管內膜的損傷程度，撕脫血管內皮細胞，暴露血管內皮下膠原和基質，導致血管內皮下的血小板附著，影響血管內皮細胞的功能，并且使黏附因子附著于血管內膜，形成新的管腔內壁血栓〔10〕。同時，血管內皮細胞功能失常也會減少肝素樣物質的傳遞，肝素樣物質可抑制血管平滑肌細胞的增殖，肝素樣物質對于血管平滑肌細胞的遷移增殖，具有反向調節作用〔11〕。

改變血管壁張力、血管外膜纖維化、副交感神經的反向作用、炎癥反應等都在血管再狹窄的發生發展過程中起到重要的作用〔12〕。機械性擴張血管也可引起炎癥反應，撕脫血管內皮細胞，炎性細胞浸潤釋放溶酶體酶，導致局部出現炎癥反應。炎癥反應對于血管內膜增殖，遷移并再次形成血栓起著重要的正向調節作用，可見炎癥反應也參與了血管再狹窄形成機制〔13〕。

多種信號轉導通路與血管再狹窄發生機制關系密切，這些外界的信號轉導通路交織構成了一個復雜的信號調節網絡〔14〕，血管內皮細胞在受到刺激后，通過細胞內受體，跨過細胞膜傳遞到細胞核內，影響內皮增殖相關基因轉錄，改變細胞周期，導致血管平滑肌細胞出現異常的增殖和遷移〔15〕。而這些信號轉導通路的作用比較復雜，也成為影響血管重構的重要因素。

例如脂多糖、氧化應激、炎性細胞因子等能夠刺激NF-κB信號轉導通路，NF-κB 信號轉導通路能夠影響細胞炎性因子及黏附因子的表達〔16〕，在細胞質內NF-κB與IκB家族結合，IκB家族中的IκB-α與NF-κB家族中的 p50/p65親和力較高，IκB-α在一定程度上可以抑制NF-κB 活化〔17〕。在炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的刺激下，NF-κB還可通過抑制血管平滑肌細胞的凋亡對細胞周期產生影響，引起平滑肌細胞堆積、內膜過度增生，參與炎癥、感染、免疫反應、細胞凋亡等過程，從而在血管再狹窄中扮演重要角色〔18〕。

MAPK信號轉導通路可通過引起細胞核產生反應，在細胞多種功能中起著重要的調控作用〔19〕，尤其與細胞增殖、分化與凋亡及細胞骨架重構的機制產生關系密切。細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)、應激激活的蛋白激酶(SAPKs)，又稱為 JNK及蛋白激活激酶(p38MAPK)是組成MAPK信號轉導通路的重要成員〔20〕。

Ras-Raf-MEK-ERK1/2則是血管平滑肌細胞增殖的經典信號轉導途徑，激活上游激活蛋白，激活Raf，進而可以依次激活 MEK 和 ERK1/2〔21〕，ERK1/2信號轉導通路在激活后，對于細胞的增殖、遷移具有重要的調控作用，并且能夠影響相關炎癥因子，例如TNF-α、IL-1β、IL-6的表達〔22〕。球囊損傷后ERK1/2 蛋白活性增高，在血管損傷后7～14 d仍然高表達，提示 ERK1/2 可能參與了血管再狹窄的形成過程〔13〕。轉染血管平滑肌細胞可以抑制 PTCA 術后損傷血管組織中ERKs 和 JNKs 的活化水平，引起內膜血管平滑肌細胞增殖降低〔23〕。有學者分別應用 MAPK 通路中ERK、JNK 和 p38 的特異性抑制劑 PD98059、SP600125 和 SB202190，在幼鼠動物模型進行體外的實驗研究〔24〕，發現它們不同程度地減弱了血管平滑肌細胞的增殖，其中以 ERK 特異性抑制劑 PD98059 的抑制作用最大。以上研究充分說明 MAPK 信號通路在調控血管平滑肌細胞的增殖及血管成形術后的再狹窄中的作用。

本研究發現，豁痰通絡方能夠顯著降低 p-IkB-α、p-p65的表達，顯著增加IκB-α、p65表達量。豁痰通絡方可以有效抑制大鼠頸動脈球囊損傷后新生內膜的增殖，可能通過調控NF-κB信號通路來抑制新生內膜的增殖。

NF-κB 信號轉導通路在血管再狹窄過程中影響血管平滑肌細胞增殖起著非常重要的調控作用，根據血管再狹窄生理及病理變化進程，從分子生物學角度來研究影響細胞信號通路的基因治療等方法來抑制血管再狹窄〔25〕，可取得了良好的遠期效果，為我們提供一條新的再狹窄防治思路?？傊?，針對血管平滑肌細胞增殖信號轉導調控機制的研究，將為再狹窄等血管增殖性疾病的防治提供充分的理論依據。