雙靶向紫杉醇聚酰胺聚合物膠束體外抗腫瘤作用及機制

趙紅陽 王瑩 盛世東 姜琳 劉月平 趙慶蘭

(1吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春 130021；2吉林省肝膽病醫(yī)院；3解放軍九六四醫(yī)院)

紫杉醇(PTX)最早是在紫杉的樹葉、樹皮、嫩枝等部位提取分離得到的天然物質(zhì)，是目前臨床上被廣泛應(yīng)用的抗腫瘤化療藥物〔1～5〕。PTX的溶解性問題是其制劑的首要問題〔6～8〕。另外，PTX作為細胞毒性的抗腫瘤藥物，因為缺乏腫瘤靶向性，甚至導(dǎo)致全身性毒性〔7〕，特別是中性粒細胞減少癥等免疫性疾病，這使得其臨床應(yīng)用受到很大限制〔10～12〕。前期研究中已制備出以聚酰胺聚合物(PAMAM)-聚乙二醇(PEG)為骨架的葉酸(FA)/透明質(zhì)酸(HA)雙靶向載PTX膠束，載藥量為18.5%，本研究擬分析FA/HA雙靶向PTX-PAMAM膠束體外抗腫瘤作用及機制。

1 材料與方法

1.1試劑 PTX購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；PAMAM購自威海晨源分子新材料有限公司；透析袋、NH2-PEG2000-COOH均購自北京索萊寶科技有限公司；二甲亞砜、十水合四硼酸鈉均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硼酸購自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亞胺、HA、FA、十八胺、N,N一二環(huán)己基碳二亞胺、甲酰胺、N,N一二甲基甲酰胺均購自麥克林；人乳腺癌(MCF-7)細胞株購自南昌樂悠生物科技有限公司。

1.2儀器 酶標(biāo)儀(Biocell)；超凈工作臺(AIR TECH)；倒置顯微鏡(OLYMPUS CK40)；流式細胞儀美國(BD公司)；細胞培養(yǎng)箱(三洋電機株式會社)；激光共聚焦顯微鏡FV1000(Olympus公司)。

1.3細胞培養(yǎng) DMEM培養(yǎng)基中加入雙抗、10%胎牛血清，用于培養(yǎng)MCF-7心肌細胞，當(dāng)細胞的貼壁密度處于70%～80%時，用含有0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶輕輕吹打消化、傳代至所需培養(yǎng)皿中進行實驗。

1.4MTT檢測細胞存活率 Control組(空白對照組加入同等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)〕、膠束(0.05、0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μg/ml)刺激12、24、48、72 h，進行MTT檢測，采用96孔板接種細胞，細胞密度為1×106個/孔，培養(yǎng)24 h后給藥，進行孵育，每孔加入20 ml MTT(5 g/L)，在37℃細胞培養(yǎng)箱孵育4 h，吸除上清，每孔加入 150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻后，用酶標(biāo)儀檢測570 nm處的各孔OD值。細胞增殖率=OD處理孔/OD陰性對照孔×100%。

1.5流式細胞儀檢測膠束的細胞攝取情況 采用6孔板接種細胞，分組給藥后，在37℃細胞培養(yǎng)箱放置24 h，加入PBS后洗滌5 min，重復(fù)3次后進行封片，加入2 ml培養(yǎng)液運用流式細胞儀檢測熒光，流式細胞儀的激發(fā)波長設(shè)置為488 nm。實驗分組：①時間依賴性梯度：膠束(10 μg/ml)刺激0.5 h、1.0 h、2.0 h、6.0 h、8.0 h、24.0 h。②膠束上的FA基團與受體結(jié)合能力：Control組(空白對照組加入同等體積的PBS)、FA(1、10、25 mg/ml)預(yù)處理1 h。③膠束的細胞內(nèi)吞機制：Control組、蔗糖組(網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞抑制劑，0.45 mol/L)、氯丙嗪組(網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)陷抑制劑，10 μg/ml)、秋水仙堿組(巨胞飲抑制劑，10 μmol/L)、吲哚美辛組(小窩蛋白介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞抑制劑，100 μmol/L)。

1.6共聚焦顯微鏡檢測膠束的胞內(nèi)定位 采用6孔板接種細胞，分組給藥后，在37℃細胞培養(yǎng)箱放置24 h，加入PBS后洗滌5 min，重復(fù)3次后進行封片，加入2 ml培養(yǎng)液運用共聚焦熒光顯微鏡檢測熒光，膠束的熒光顯微鏡的激發(fā)波長設(shè)置為488 nm(綠色)，用4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進行細胞核染色，DAPI的激發(fā)波長為 358 nm(藍色)。實驗分組：溶酶體紅色熒光探針組、線粒體紅色熒光探針組、高爾基體紅色熒光探針組、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針組。利用異硫氰酸熒光素(FITC)(綠色熒光)標(biāo)記膠束，ER-Tracker紅色熒光探針標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，Golgitracker紅色熒光探針標(biāo)記高爾基體，Mitotracker紅色熒光探針標(biāo)記線粒體，Lysotracker紅色熒光探針標(biāo)記溶酶體，DAPI藍色熒光探針標(biāo)記細胞核，通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞中膠束與各類細胞器的熒光共定位。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism5軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1膠束對腫瘤細胞存活率的影響 體外培養(yǎng)MCF-7腫瘤細胞，用含膠束(0.05、0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μg/ml)培養(yǎng)基刺激細胞12、24、48、72 h，進行MTT檢測。各組細胞生存率均呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和時間依賴性降低趨勢。見表1。

表1 各組刺激不同時間點MCF-7細胞活性

2.2膠束的細胞攝取 腫瘤細胞對膠束的攝取呈現(xiàn)時間依賴性增加趨勢(膠束刺激0.0、0.5、1.0、2.0、6.0、8.0、24.0 h細胞內(nèi)熒光密度分別為100%、119%、125%、128%、137%、135%、168%)；隨著FA濃度的增加，腫瘤細胞對膠束的攝取呈現(xiàn)濃度依賴性降低趨勢(Control組、FA 1、10、25 mg/ml組細胞內(nèi)熒光密度分別為100%、98%、85%、59%)；較Control組(100%)，秋水仙堿組細胞攝取(76%)明顯降低(P<0.05)，氯丙嗪組、吲哚炎率組、蔗糖組(分別為102%、100%、101%)降低不明顯。

2.3膠束的細胞內(nèi)定位 膠束與溶酶體有較強的共定位，提示膠束入胞后大部分聚集在溶酶體中。見圖1。

膠束：FITC綠色熒光；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：紅色熒光；高爾基體：紅色熒光；線粒體：紅色熒光；溶酶體：紅色熒光；細胞核：DAPI藍色熒光圖1 膠束的細胞內(nèi)定位(×40)

3 討 論

惡性腫瘤已經(jīng)成為影響人類健康的主要疾病之一，化療是主要方法之一〔13～16〕，但化療藥物又存在缺乏靶向性和毒副作用大的缺陷。所以設(shè)計構(gòu)建毒副作用小，靶向性高的抗腫瘤靶向載體系統(tǒng)具有很好的藥學(xué)研究前景。

本文結(jié)果表明，膠束組細胞生存率呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和時間依賴性降低趨勢。添加游離的FA可以有效地抑制膠束的攝取，游離的FA與膠束上的FA基團競爭性地結(jié)合腫瘤細胞上的FA受體，從而抑制了腫瘤細胞對膠束的靶向性攝取。腫瘤細胞對膠束的攝取依賴巨胞飲內(nèi)吞機制，內(nèi)吞后大部分膠束聚集在溶酶體中，而其具體作用機制尚需進一步研究。

綜上，F(xiàn)A/HA雙靶向PTX-PAMAM膠束在體外呈現(xiàn)明顯的抗腫瘤作用，其作用機制與腫瘤細胞對膠束的靶向性攝取、巨胞飲內(nèi)吞作用及溶酶體聚集相關(guān)。