異丙腎上腺素制作大鼠心力衰竭惡病質模型及心功能和營養指標的變化

秦瑞麗 董志強 張昕 樊勤梅 趙欣

(內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院 1心功能科，內蒙古 包頭 014010；2藥劑科)

慢性心力衰竭(心衰)后期與惡性腫瘤相似，常會伴有機體消耗，表現為厭食、消瘦、貧血等，與葡萄糖、蛋白質代謝異常和脂肪組織分解、肌肉萎縮等相關，隨著肌肉、脂肪組織和骨組織減少到一定程度就會出現以體重減輕、機體構成改變為特征的心衰惡病質(CC)〔1〕。流行病學調查發現，CHF患者中有10%～16%合并有惡病質的發生，其中50%患者在18個月內死亡，CC是心衰患者死亡的一個獨立危險因素〔2〕。然而，其發生機制目前尚未明確，臨床上所能采取的應對措施也非常有限。異丙腎上腺素(ISO)是常用的制作擴張型心肌病大鼠模型的藥物，其主要的藥理作用是通過激動心肌細胞上的β1受體，引起心肌細胞的強烈收縮造成心肌細胞缺血、損傷和斷裂〔3〕。本研究擬探索制作心衰惡病質特征大鼠模型的ISO劑量。

1 材料與方法

1.1DCM大鼠模型的建立 選用清潔級10～12周齡雄性SD大鼠100只，體重280～300 g，由內蒙古大學實驗動物中心提供。按照內蒙古實驗動物飼養管理標準執行，北京科澳協力飼料有限公司提供的飼料為標準柱狀飼料。動物分籠飼養于有空氣過濾系統的安靜環境中，室溫維持在20～25℃，大鼠正常進食與活動。ISO由大連美侖生物有限公司提供。適應性飼養1 w后，隨機抽取90只腹股溝皮下注射不同劑量的ISO制作心衰模型，分別為低劑量組〔120 mg/(kg·d)〕、中等劑量組〔180 mg/(kg·d)〕及高劑量組〔250 mg/(kg·d)〕。其余10只大鼠注射等體積9 g/(L·d)生理鹽水作為對照組。注射ISO的方法：用0.9%生理鹽水溶解粉劑ISO，終濃度為20 mg/ml，按3個劑量級，隔日1次，共2次，為了避免皮膚壞死，第2次換作另一側進行注射，所有大鼠用藥后正常進食和活動，飼養4 w后根據體重變化及超聲心動圖結果將ISO組分為CC組(較對照組體重下降>6%)與心衰非惡病質組(其余大鼠)。

1.2一般情況觀察 注射ISO后觀察大鼠的皮毛顏色、進食、活動等，記錄死亡情況。

1.3模型成功的評價方法 (1)超聲心動圖檢查：注射藥物后清潔環境下飼養大鼠4 w后行超聲心動圖檢查，10%的水合氯醛腹腔注射進行麻醉，取仰臥并固定四肢和頭部于干凈木板上。剪除胸部體毛，用S4-2高頻探頭飛利浦HD11XE彩色超聲診斷儀，在二維超聲引導下，選取左室乳頭肌短軸切面進行檢查。測量指標包括左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)、左室射血分數(LVEF)及短軸縮短率(FS)，每只測5個心動周期，取平均值。(2)組織病理學檢查：取大鼠心肌組織，用冰生理鹽水沖洗2遍，快速置于固定液(即95%乙醇：40%甲醛原液=9∶1的混合固定液)中固定后常規石蠟包埋，行Masson染色，光鏡下觀察心肌細胞組織學形態變化。(3)體重變化:所有大鼠注射藥物前及注射后4 w分別記錄體重。

1.4生化營養指標檢測 注射藥物4 w后，大鼠禁食12 h，取腹主動脈血分離血清，全自動生化分析儀檢測血清中總白蛋白、三酰甘油、膽固醇、血糖。

1.5標本的收集和處理 (1)采集血樣：大鼠腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，取仰臥位，固定四肢和頭部于手術臺上，腹部去毛，于手術部位用5%乙醇消毒，從劍突下腹正中線切口，分層打開腹腔。在腎動脈分支以下鈍性游離腹主動脈，連接采血管，采血量>5 ml，所采血于常溫下保存30 min后，4℃，3 000 r/min離心5 min，分離血清，將其分成2小管，置于-20℃冰箱下保存，用于生化營養指標檢測及酶聯免疫吸附試驗測定胰島素、胰島素樣生長因子濃度。(2)心肌標本處理：取大鼠心肌組織，生理鹽水沖洗2遍，去除表面水分及結締組織，立刻置于固定液中，室溫保存24 h后石蠟包埋，用于Masson染色。

1.6統計學分析 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、q檢驗、χ2檢驗及Fisher確切概率法。

2 結 果

2.1動物的一般情況 注射ISO藥物后90只大鼠死亡19只，大部分于注射藥物12 h內死亡，死亡率為 21.1%。其中高劑量組死亡10只，死亡率33.3%；中等劑量組死亡6只，死亡率20.0%；低劑量組死亡3只，死亡率10.0%。3組比較有統計學差異(P<0.05)。而對照組無死亡。與對照組相比，注射ISO大鼠大部分出現口唇發紺，口中出現血性分泌物，皮毛發黃無光澤，活動量明顯減少，體重無明顯增加。

2.2超聲心動圖結果 與對照組相比，ISO組LVEDD、LVESD顯著增大(P<0.05)，LVEF顯著降低(P<0.05)，見表1、圖1。進一步比較，高劑量組、中等劑量組的 LVEDD、LVESD與ISO組比較差異無統計學意義(P>0.05)；低劑量組 LVEDD、LVESD明顯小于ISO組(P<0.05)；高劑量組、中等劑量組的LVEF明顯低于ISO組(P<0.05)，但低劑量組與ISO組無統計學差異(P>0.05)。

表1 對照組與ISO組心功能比較

圖1 對照組與ISO組超聲心動圖

2.3體重變化 注射藥物前ISO組與對照組體重無統計學差異(P>0.05)，注射藥物4 w后CC組體重顯著低于心衰非惡病質組和對照組(P<0.05)，心衰非惡病質組低于對照組(P<0.05)，見表2。

2.4生化營養指標變化 總蛋白在CC組顯著低于對照組(P<0.05)，與心衰非惡病質組比較無顯著差異(P>0.05)，但心衰非惡病質組顯著低于對照組(P<0.05)。三酰甘油、膽固醇在CC組顯著高于非惡病質組和對照組(P<0.05)，但心衰非惡病質組與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。血糖在CC組顯著低于非惡病質組和對照組(P<0.05)，但心衰非惡病質組與對照組比較無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 各組體重及生化營養指標比較

2.5心肌組織病理學觀察 ISO組心肌纖維排列紊亂，心肌細胞肥大且可見壞死消失，被大量纖維組織(綠色染色處)所取代，見圖2。

圖2 各組心肌組織(Masson染色，×100)

3 討 論

CC是心衰后期出現的營養不良綜合征，要想制作CC模型，首先需制作大鼠心衰模型。目前在實驗研究中，大鼠模型常用的制作方法有藥物注射法(ISO、阿霉素等)、結扎冠脈法、心臟超負荷法等〔4〕。大量的研究表明，通過小劑量長時間注射ISO建立心衰模型成功率高，大鼠死亡率低且操作簡單易行，但時間較長，重復性較差〔5〕；也有研究用腹股溝皮下注射250 mg/(kg·d)ISO連續2 d制作心衰模型，但其死亡率較高并出現注射部位無菌性壞死〔6〕。本實驗參考之前的研究探索3個級別ISO劑量制作模型的成功率，發現180 mg/(kg·d)、隔日1次、共2次注射ISO是最佳的劑量選擇，該劑量組大鼠模型死亡率較低，注射部位未見明顯無菌性壞死，并且超聲心動圖及心肌組織病理學結果均提示心衰模型建立成功，造模時間短，重復性好。

根據CC診斷標準，在心衰模型建立成功的前提下，其體重下降超過6%者才符合〔7〕。實驗中所選大鼠在注射藥物前體重相當，注射ISO 4 w后發現部分大鼠體重較對照組下降超過6%，說明心衰后期部分大鼠合并有惡病質的發生。類似的對癌性惡病質的研究也提到，只將體重下降程度作為判斷大鼠是否進入惡病質狀態不太準確，因此為了證實實驗的分組是否合理，CC組是否進入惡病質狀態，本研究還進行了生化營養指標測定，結果可以看出大鼠存在顯著的營養不良和蛋白質、糖類、脂類代謝紊亂，低血糖可能與惡病質狀態下肝臟糖原儲備減少有關，而外周血膽固醇增加與脂肪組織分解增加相關〔8〕。研究證實心衰患者三酰甘油、膽固醇總量未發生明顯改變，而亞油酸含量明顯增高，花生四烯酸明顯降低，即膽固醇酯中多不飽和脂肪酸發生了改變，導致其改善血管內皮功能及血管順應性的功能下降，說明心衰患者僅存在脂肪酸代謝紊亂而尚未出現顯著的脂類代謝紊亂〔9〕。相關的臨床研究報道也提出膽固醇與心衰的發生相關性不大，而高密度脂蛋白、低密度脂蛋白與心衰的發生關系密切〔10〕。因此CC組與心衰非惡病質組間有明顯差別，前者體內存在顯著的脂類代謝紊亂。本研究可以看出心衰時總蛋白下降，而CC時總蛋白、血糖均顯著降低，說明兩者均存在營養不良，只是程度不同而已，兩者血糖差異有統計學意義，可能與CC體內胰島素水平異常升高有關。

總之，CC組與非惡病質組在三大物質代謝方面有顯著差異，前者存在顯著的營養不良和蛋白質、糖類、脂類代謝紊亂，明顯處于惡病質狀態，說明本研究的分組符合標準，證實了CC大鼠模型建立成功。