知母皂苷對(duì)慢性乙醇中毒小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和突觸可塑性的影響

趙喆 張昊婧 隋海娟 劉琪 劉卓

(1錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000；2鐵嶺衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院)

研究表明，長期過量飲酒會(huì)使大腦活動(dòng)受抑制，引起神經(jīng)損傷、導(dǎo)致學(xué)習(xí)與記憶障礙〔1，2〕。突觸可塑性參與神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育和損傷修復(fù)，在慢性酒精中毒的學(xué)習(xí)記憶障礙形成中扮演了重要角色。長期乙醇使用導(dǎo)致了突觸可塑性功能損傷，并減少突觸特異性標(biāo)志蛋白的表達(dá)，而直接對(duì)酒精引起的結(jié)構(gòu)可塑性分子機(jī)制的研究仍然不清楚〔3，4〕。知母皂苷(SAaB)由百合科植物知母的根莖炮制而成，有防治老年癡呆癥〔5〕、抗炎〔6〕、抗凝血、抗氧化〔7〕等廣泛的生物活性和藥理作用。本實(shí)驗(yàn)探討SAaB對(duì)慢性乙醇中毒所致小鼠空間學(xué)習(xí)記憶損害和突觸可塑性相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 SPF級(jí)雄性12月齡昆明小鼠，體重22～30 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001，NO：211002300014062。SAaB由成都普瑞法科技開發(fā)有限公司提供，批號(hào)：S08039，高效液相色譜法(HPLC)分析純度>98%，分子質(zhì)量為416.64。鼠突觸素(SYP)單克隆抗體、兔突觸后致密蛋白(PSD)95多克隆抗體、突觸小體相關(guān)蛋白(SNAP25)抗體及山羊抗兔、山羊抗鼠二抗購自Santa Cruz公司；β-actin抗體購自Beyotime試劑公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒、放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，其他相關(guān)試劑由錦州醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供〔8〕。Morris水迷宮系統(tǒng)購自中國淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，熒光顯微鏡購自(ZDM-500Z)德國Leica，全自動(dòng)熒光和化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Bio Spectrum 510)購自美國UVP，微量紫外分光光度計(jì)(Nano Drop 2000c)購自美國Thermo Scientific等。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 40只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為正常對(duì)照組(NC組)、乙醇組(E組)和SAaB低劑量組(SL組)、SAaB高劑量組(SH組)各10只。乙醇組和SAaB組小鼠灌胃(ig)給予30%(V/V)乙醇10 ml/kg制作慢性乙醇中毒小鼠模型，對(duì)照組ig等量蒸餾水，連續(xù)4 w。灌胃同時(shí)分別對(duì)SL組和SH組腹腔注射(ip)SAaB 100、200 mg/kg，NC組和E組ip等量生理鹽水，連續(xù)4 w。

1.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 各組進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，水迷宮為直徑100 cm、高50 cm的圓形水池，水深25 cm，水溫22～24℃，內(nèi)置直徑7.5 cm的可移動(dòng)平臺(tái)。①定位航行實(shí)驗(yàn)：第1～3天為學(xué)習(xí)階段，平臺(tái)高出水面1 cm置于NE象限，參照物懸掛于平臺(tái)對(duì)側(cè)。將小鼠面向池壁從距平臺(tái)最遠(yuǎn)象限放入水中，若在120 s內(nèi)成功找到平臺(tái)，則更換入水位置進(jìn)行第2次訓(xùn)練；若120 s內(nèi)不能找到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái)停留10 s，每只訓(xùn)練4次。第4～8天移動(dòng)平臺(tái)至SE象限，參照物移動(dòng)至平臺(tái)對(duì)側(cè)，加水使水面沒過平臺(tái)，記錄找到平臺(tái)所需要的時(shí)間(逃避潛伏期)。②空間探索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的次日移除平臺(tái)，參照物不動(dòng)，其余方法同前。記錄在目標(biāo)象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間的百分比，以判斷記憶存儲(chǔ)、提取及再現(xiàn)能力。

1.4Western印跡法測定海馬組織突觸相關(guān)蛋白 水迷宮試驗(yàn)后，每組任選4只小鼠麻醉后直接斷頭，收集大腦海馬組織。經(jīng)過組織蛋白提取、電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交、顯色，測定各組海馬區(qū)SNAP25、SYP、PSD95和神經(jīng)元核蛋白(NeuN)表達(dá)水平變化。

1.5免疫組織化學(xué)觀察海馬NeuN表達(dá) 從每組中任選4只作免疫組化檢測，灌流取全腦，固定，制作冰凍切片行增強(qiáng)免疫組織化學(xué)染色(IHC)，在熒光顯微鏡下觀察，并進(jìn)行照相及分析，觀察NeuN表達(dá)情況。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Post-hoc多重比較。

2 結(jié) 果

2.1空間學(xué)習(xí)記憶能力 在定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組逃避潛伏期隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長逐漸縮短。第4～8天，與NC組相比，E組逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；SL和SH組逃避潛伏期較E組明顯縮短(P<0.05)，見表1。空間探索實(shí)驗(yàn)中，與NC組相比，E組目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.05)，SL和SH組在平臺(tái)象限停留時(shí)間較E組明顯延長，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.05)，見表2，圖1。

表1 各組不同訓(xùn)練時(shí)間逃避潛伏期比較

表2 各組平臺(tái)象限停留時(shí)間占總游泳時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)次數(shù)比較

圖1 各組空間探索試驗(yàn)游泳軌跡

2.2海馬組織突觸相關(guān)蛋白測定 與NC組相比，E組海馬組織中SNAP25、SYP、PSD95水平明顯減少(P<0.01)，與E組比較，SL和SH組SNAP25、SYP、PSD95水平明顯升高(P<0.01)。見表3和圖2。

表3 各組海馬組織中SNAP25、SYP、PSD95蛋白表達(dá)水平

圖2 各組海馬組織SNAP25、SYP和PSD95表達(dá)水平

2.3海馬齒狀回NeuN形態(tài)學(xué)變化 與NC組相比，E組海馬DG區(qū)NeuN數(shù)目明顯減少(紅色)，細(xì)胞出現(xiàn)碎裂，細(xì)胞核不完整。SH組較E組NeuN表達(dá)明顯增多，細(xì)胞形態(tài)及完整度均有所增強(qiáng)。見圖3。

圖3 各組海馬齒狀回NeuN增強(qiáng)免疫熒光染色(×200)

3 討 論

研究表明，乙醇及其在代謝過程中產(chǎn)生的乙醛透過血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)，通過影響不同的神經(jīng)通路及神經(jīng)遞質(zhì)釋放，使機(jī)體出現(xiàn)多種行為改變及神經(jīng)損傷〔8～10〕。海馬是學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵部位，NeuN是一種表達(dá)在成熟神經(jīng)細(xì)胞核中的特異性核蛋白，研究發(fā)現(xiàn)長期酒精暴露使小鼠成熟神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少〔11〕。本研究證明了SAaB對(duì)慢性乙醇中毒引起的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。

在神經(jīng)信息傳遞過程中，突觸是傳遞的關(guān)鍵部位，也是神經(jīng)可塑性變化中最敏感的部位，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，不斷有新的突觸形成〔12〕。如損傷、學(xué)習(xí)等適應(yīng)性變化的過程中，突觸表現(xiàn)出強(qiáng)大的變異性，通過從神經(jīng)元到神經(jīng)環(huán)路的適應(yīng)性變化以維持神經(jīng)功能相對(duì)穩(wěn)定，這種變化即突觸可塑性。在突觸前、后膜中，存在許多可調(diào)節(jié)突觸可塑性的信號(hào)分子，突觸前膜上的SNAP25，為神經(jīng)遞質(zhì)釋放所必需的突觸前膜蛋白〔13〕，研究發(fā)現(xiàn)酒精處理的小鼠大腦中SNAP25含量明顯減少，小鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，表現(xiàn)為Morris水迷宮試驗(yàn)潛伏期延長，這一結(jié)果與本研究相一致。SYP和PSD95雖產(chǎn)生部位不同，但都與突觸的形成和成熟密切相關(guān)〔14〕。其中SYP數(shù)量減少提示突觸數(shù)量減少，突觸囊泡減少，進(jìn)而影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，SYP丟失程度與記憶缺失程度成正相關(guān)，在行為上表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶障礙〔15〕。而突觸后致密物質(zhì)是突觸可塑性中最為敏感的物質(zhì)，小鼠連續(xù)飲用酒精2個(gè)月后突觸后致密物質(zhì)厚度顯著變小，說明其內(nèi)的各種蛋白的量減少，而這些蛋白減少必定會(huì)使神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞速度降低〔16〕。本研究證明SAaB可明顯改善這種損傷性改變，其機(jī)制可能與通過增加突觸相關(guān)蛋白，進(jìn)而影響突觸可塑性有關(guān)。

綜上，SAaB可明顯改善慢性乙醇中毒所致的小鼠空間學(xué)習(xí)記憶損害，可能是通過對(duì)海馬組織神經(jīng)元的保護(hù)和調(diào)節(jié)突觸可塑性相關(guān)的信號(hào)分子有關(guān)。