銀杏葉提取物對大鼠局灶性腦缺血再灌注組織中缺氧誘導因子-1α表達的影響

王淑英 王為光 高占群 李堯 李文 侯麗然 劉月霞 趙文杰

(佳木斯大學 1基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007；2附屬第一醫院；3海南醫學院第一附屬醫院)

由缺血導致的腦血管疾病有發病率高、死亡率高、復發率高的特點，且再灌注過程中伴有腦組織進一步損傷。目前，臨床尚不能完全闡述缺血再灌注損傷的發病機制，對其還缺乏有效的治療手段。本實驗旨在通過觀察腦缺血再灌注損傷后大鼠的神經病學行為、神經元病理學變化、缺氧誘導因子(HIF)-1α表達及銀杏葉提取物(EGB)對其影響，探討EGB發揮腦組織保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 Wistar大鼠，性別不限，體重280～380 g，被隨機分為假手術組(n=15)：分離大腦中動脈，不進行栓塞；模型組(n=15)：栓塞大腦中動脈2 h，再進行24 h灌注；EGB治療組(n=15)：栓塞大腦中動脈2 h，栓塞后2 min內通過尾靜脈注射EGB(20 mg/kg)，再進行24 h灌注，期間共給藥3次。大鼠術前自由飲水，禁食12 h。

1.2模型制備 參考Nagasawa等〔1〕、汪家龍等〔2〕、羅勇等〔3〕報道的方法，頸內動脈線栓法制備腦缺血模型。將大鼠用3.5%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉。固定，正中切開頸部皮膚，將右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)鈍性游離。由CCA分叉處向頭端依次游離，ECA的分支用電熱燒灼器燒斷，使其主干游離。再分離ICA至顱底。將CCA和ICA用蛙心夾夾住，在ECA(近CCA分叉處)上剪一小口，將栓子沿切口插入，經CCA分叉處并將事先放置在ECA根部的手術縫合線扎緊，防出血和栓子滑出，放開ICA上的蛙心夾，將栓子緩慢地向ICA入顱方向插入19～21 mm，稍有阻力即止，栓子頭端停留在大腦中動脈(MCA)與大腦前動脈的分叉處，固定栓子，栓塞完成。2 h后，將栓子輕拉使其頭端回到ECA內，即開始MCA再灌注。假手術組除不插線外，其他皆同模型組。EGB治療組術后2 min內大鼠尾靜脈注射EGB，20 mg/kg，3次/d，假手術組和模型組注射同等量的生理鹽水。每組均在再灌注24 h后取材。

1.3神經病學評分 參照Kuluz等〔4〕三級神經病學評分標準。評分如下：0級：大鼠活動正常，無缺陷；1級：大鼠右側Horner征呈陽性；2級：將大鼠提尾懸空，其左前肢曲屈、內收；3級：自主運動時大鼠向偏癱側(左側)劃圈。腦缺血后，大鼠1、2、3級體征都有的被視為造模成功，可進行后續試驗。

1.4腦組織病理學觀察 參照陳春花等〔5〕報道的方法，腹腔麻醉后大鼠進行左心室插管灌注，室溫條件下快速灌注250 ml生理鹽水，4℃條件下緩慢灌注150 ml 4%多聚甲醛1 h左右后快速取腦，6～8 h 4%多聚甲醛溶液固定，再入30%的蔗糖中，待組織沉底后制20 μm厚的冰凍切片，每間隔5張切片取1張，然后將切片進行Nissle染色。

1.5HIF-1α免疫熒光組織化學法測定 參考陳春花等〔5〕報道的方法，切片在0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)內搖洗3次后，Triton X-100液30 min(37℃)，3%過氧化氫20 min(避光)，血清封閉20 min(37℃)，分別滴加1∶100抗HIF-1α抗體于切片上，4℃冰箱過夜。第2天復溫1 h后PBS搖洗3次，滴加熒光抗體37℃30 min，PBS搖洗3次，37℃恒溫水浴箱20 min，PBS搖洗3次，封片。

2 結 果

2.1神經病學評分 假手術組體征無變化；模型組缺血2 h內體征為右側Horner征陽性，提尾時左前肢內收、屈曲，爬行時向左劃圈，再灌注后24 h、仍表現為Horner征陽性，提尾時左前肢屈曲內收，爬行時向左劃圈；EGB治療組神經病學評分較模型組(15例均為Ⅲ級)有明顯改善，缺血2 h再灌注24 h后46.67%(7例)大鼠評分由Ⅲ級轉為Ⅱ級(5例)或Ⅰ級(2例)。

2.2腦組織病理學觀察 假手術組：光學顯微鏡下觀察，大腦皮質神經元形態結構完整、清晰，無水腫現象。神經元胞體較大，可見尼氏體核大、淡染、圓且規整，核仁明顯，染色質分布均勻。模型組：神經元胞體腫脹，尼氏體減少或溶解，核固縮或溶解。部分神經元皺縮，變形呈三角形。EGB治療組：神經元胞體仍有腫脹，但腫脹明顯減輕，結構較清晰，核固縮、尼氏體溶解程度均較模型組減輕(圖1)。

圖1 各組腦組織尼氏體(Nissle染色，×400)

2.3HIF-1 α免疫熒光結果 假手術組未見HIF-1α表達，模型組HIF-1α表達明顯，EGB治療組HIF-1α表達較MCAO/R組明顯增多(圖2)。

圖2 各組HIF-1α表達(免疫組織化學，×100)

3 討 論

銀杏被作為藥用植物使用的歷史由來已久，在宋朝時銀杏葉就被用于治療哮喘和支氣管炎。有實驗表明，EGB對高血壓、冠心病、心絞痛、動脈硬化、老年性記憶減退、老年性癡呆、腦功能減退、衰老等與心腦血管循環有關的疾病有顯著的預防和治療效果〔6，7〕。這些研究主要集中在動物神經行為學方面的改善或藥物依賴中的相互作用等方面，對中樞神經系統病理損傷作用的研究較少。HIF-1主要由α和β兩個亞基構成，屬于具有螺旋一環一螺旋(BHLH)/Per-Arnt-Sim(PAS)結構域的蛋白家族成員。HIF-1的功能實際上依賴于α亞基的蛋白質水平與活性〔8〕。HIF-1α在缺氧缺血性腦損傷中起重要作用〔9〕。HIF-1α在全身缺氧、各種缺血腦組織中被激活。永久結扎成年大鼠大腦中動脈〔10〕，在缺血半影區，缺血7.5 h后能觀察到HIF-1α mRNA表達上調，缺血19～24 h達最高值。在HIF-1α mRNA表達上調的缺血半影區，局灶性腦血流量減少，推測腦血流量減少致O2供應減少，進而誘導HIF-1α mRNA表達增強〔11〕。HIF-1α為一種轉錄因子，可對多種基因的轉錄進行調節，其轉錄產物能使細胞耗氧量降低，或使缺氧組織的氧供應增加，從而緩解氧供與求之間的矛盾，維持內環境穩定。機體對缺氧產生了耐受和適應，在缺血缺氧導致腦血管病的發病及病程發展過中，HIF-1α產生將對其形成保護〔8〕。本研究結果提示腦缺血再灌注損傷過程中EGB能誘導HIF-1α表達增加，對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。