胡桃醌對人胃癌細胞SGC-7901凋亡相關基因p53蛋白表達的影響

王若汗 李慶杰 成光宇 張鳳清

(1長春工業大學化學與生命科學學院，吉林 長春 130012；2長春中醫藥大學附屬醫院)

胡桃醌(Juglone，Nuein)又名5-羥基-1,4-萘醌，是從胡桃楸新鮮根皮、枝皮、青果皮中分離出來的羥基萘醌類化合物〔1〕，具有抗菌、降血糖、抗腫瘤等生物活性〔2〕。Zhang等〔3〕通過將不同濃度的胡桃醌與宮頸癌細胞孵育，溴化四氮唑藍(MTT)法檢測胡桃醌對宮頸癌細胞增殖的抑制作用。通過觀測細胞凋亡的發生，Western印跡法檢測凋亡相關蛋白的表達。結果表明，胡桃醌對人宮頸癌細胞的生長有抑制作用，且呈劑量依賴性。Kiran等〔4〕通過流式細胞術分析凋亡/壞死誘導，觀察到細胞存活率與胡桃醌的濃度依賴性降低，而乳酸脫氫酶水平相應升高。表明胡桃醌有可能在黑色素瘤腫瘤細胞中誘導細胞遺傳學損傷。Fang等〔5〕通過MTT法分析胡桃醌對SKOV3細胞增殖的抑制作用，研究了用胡桃醌處理的SKOV3細胞的細胞周期和凋亡，通過蛋白質印跡分析法檢測細胞周期蛋白D1、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)，Bax、細胞色素(Cyt)c、caspase-9和caspase-3的蛋白表達水平。表明胡桃醌可以誘導人卵巢癌細胞(SKOV3)細胞凋亡，并伴有caspase-9和caspase-3活化，降低了Bcl-2水平并增加Bax和Cytc水平，并且能夠充分抑制侵襲，同時明顯降低基質金屬蛋白酶(MMP)-2的表達。本研究分析胡桃醌對人胃癌細胞SGC-7901凋亡相關基因β-蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1藥品 胡桃醌單體(成都普菲德生物技術有限公司)，純度99.1%。

1.2主要試劑 胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰酶、RPMI1640培養基(Invitrogen公司)；細胞計數試劑盒8(廣州市碩恒生物科技有限公司)；BeyoECL plus(上海碧云天生物技術有限公司)；MTT(Sigma公司)。

1.3細胞株 宮頸癌細胞(HELA)，SGC-7901，人肝癌細胞株(Hep-2)，人肺腺癌細胞株(A549)，乳腺癌細胞株(MCF7)，人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y-P9)均由吉林大學基礎醫學院分子生物學教研室提供。

1.4主要儀器 INFINITE M200酶標儀(瑞士TECAN)，IX71倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)，MILI Q超純水器(美國MILLIPORE)，二氧化碳培養箱(美國 THERMO)，LD5-2B離心機(北京雷勃爾離心機有限公司)，BSA224S電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)，JB-3A恒溫磁力攪拌器(雷茲互感器(上海)有限公司)，LDZX-30KBS型蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械有限公司)；高效液相色譜儀LC-20AT(日本島津)，KQ5200DB型超聲機(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)，BS110S型電子分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)，T6新世紀紫外可見分光光度儀(北京普析通用)，EYELASB-2000旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)。

1.5細胞培養 各細胞株培養于含10% 胎牛血清(FBS)的H-DMEM培養基培養，HELA、SGC-7901、MCF-7、Hep-2、A549、SH-SY5Y-P9細胞株，37℃，飽和濕度，5% CO2培養。每周更換培養基3次，待細胞生長至對數生長期時進行細胞種板。棄去培養液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次后，加入0.25%胰蛋白酶消化細胞。

1.6制備胡桃醌樣品溶液 稱取10 mg胡桃醌樣品，加入2 ml PBS，超聲機設置功率100 W，頻率50 kHz，超聲處理10 min，使用0.22 μm濾膜過濾除菌，制成5 mg/ml樣品儲備液，放入冰箱冷藏保存。

1.7CCK8法篩選最適敏感菌株 取對數生長期的細胞在96孔培養板中培養，每孔加入100 μl，濃度為5×103，培養條件：37℃飽和濕度，5% CO2。培養24 h，空白孔和陰性對照孔加入培養液100 μl，樣品孔加入樣品溶液100 μl使終濃度為0.000 0、0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0、4.000 0 μg/ml每個濃度設3個復孔。置培養箱中培養48 h，加入10 μl CCK-8試劑，以只加100 μl完全培養液和CCK-8試劑作為空白對照。培養2 h，酶標儀450 nm測定各孔吸收值A。 細胞存活率=(A樣品-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

1.8高通量測序與生物信息學分析 按試劑盒說明提取總RNA，通過Illumina高通量測序獲取胡桃醌處理的SGC-7901和對照組細胞基因表達數據并通過R語言“DESeq2”包實現數據標準化，篩選差異表達基因的閾值設置為：|logFC|>1且P<0.05。通過R語言“ggfortify”包進行主成分分析，R語言“clusterProfiler”包用于KEGG信號通路富集分析。

1.9Western印跡方法 采用Novagen公司的Cytobnster提取SGC-7901總蛋白，提取蛋白經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠和5%濃縮膠分離，Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置設置轉膜電流300 mA,轉膜時間40 min，轉膜槽放置于冰浴中轉膜，將蛋白轉印至硝酸纖維素膜。用含5%脫脂奶粉1×Tween-20 Tris鹽酸緩沖液(TBST)浸泡硝酸纖維素膜，室溫封閉搖2 h。將封閉過的膜放于一抗稀釋液中，4℃過夜。第2天吸棄一抗稀釋液，用1×TBST洗3次，每次5 min。稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。加入稀釋好的二抗，室溫旋轉孵育1 h。吸棄二抗稀釋液后，0.1% TBST室溫下洗膜3次，每次5 min;使用BeyoECL進行染色。

1.10實時定聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測p53 mRNA表達水平 按試劑盒說明提取總RNA，GAPDH，p53的引物及擴增片段長度見表1。RT-PCR按說明書進行，擴增條件:94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 90 s，30個循環；最后72℃延伸5 min。PCR產物用含0.5 mg/L溴化乙錠的15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行，最后用凝膠成像系統Quanity one軟件分析結果，以目的基因與GAPDH條帶的相對含量比值表示。

表1 PCR引物序列和產物長度

1.11統計學方法 采用Graphpad軟件進行Anova檢驗。

2 結 果

2.1胡桃醌對SGC-7901存活率的影響 胡桃醌對6種腫瘤細胞都有一定的抑制作用，其中對人SGC-7901半數抑制濃度為0.287 3 μg/ml，是6種腫瘤細胞中最敏感細胞，以SGC-7901進行差異基因的篩選。見圖1。胡桃醌對SGC-7901活性抑制效果最為明顯，且隨著胡桃醌濃度的升高對細胞活性的抑制效果增強(濃度從小至大，P53/GAPDH值分別為(90.43±2.16)%、(69.86±1.49)%、(55.14±1.89)%、(45.37±1.23)%、(39.55±1.35)%、(36.26±1.79)%、(34.25±1.02)%，細胞存活率明顯下降時濃度為0.125 0 μg/ml，且在胡桃醌濃度達到0.250 0 μg/ml時，細胞存活率接近50%，且組間差異顯著(P<0.05)，因此選擇0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0 μg/ml濃度進行后期實驗。

圖1 不同濃度胡桃醌對6種細胞存活率的影響

2.2高通量測序差異基因篩選及生物信息學分析 通過高通量測序，獲得了胡桃醌處理的SGC-7901與對照組細胞中的31 695個基因的表達數據。通過主成分分析可知，實驗組與對照組基因表達差異較大。見圖2。然后基于|logFC|>1且P<0.05的閾值，最終篩選得到4 248個差異表達的基因，其中2 364個差異基因顯著上調，1 884個差異基因顯著下調。通過火山圖可視化該數據，進一步KEGG信號通路富集分析這些差異基因主要富集在酒精中毒信號通路、Hippo信號通路、Apelin信號通路及p53信號通路等。見圖3、4。

圖2 主成分分析

圖3 差異表達基因火山圖

圖4 KEGG信號通路富集分析

2.3凋亡相關基因蛋白表達水平檢測結果 由Western印跡結果可知，與對照組〔(98.57±3.98)%〕相比，SGC-7901凋亡相關基因p53蛋白表達水平在胡桃醌作用后顯著上調，且與胡桃醌濃度呈劑量依賴關系，其表達量隨著胡桃醌濃度的升高而升高(濃度從小至大，P53/GAPPH依次為〔(119.61±5.96)%、(131.75±5.21)%、(148.29±5.15)%、(156.14±4.37)%〕，組間差異顯著(P<0.05)。見圖5。

圖5 胡桃醌對SGC-7901 p53基因影響的Western印跡結果

2.4胡桃醌對SGC-7901 p53 mRNA表達的影響 經RT-PCR方法檢測，不同濃度胡桃醌誘導SGC-7901凋亡后p53基因mRNA表達水平較對照組(0.41±0.02)明顯增強，且與胡桃醌濃度呈劑量依賴關系，其表達量隨著胡桃醌濃度的升高而升高〔濃度從小至大，P53 mRNA/GAPDH分別為(0.51±0.02)、(0.79±0.02)、(0.83±0.02)、(0.87±0.02)，組間差異顯著(P<0.05)〕。

3 討 論

胃癌為人類常見的惡性腫瘤之一，近年來，隨著人們飲食結構的變化，胃癌的發病率也大大提升〔6〕。胃癌的侵襲和轉移過程，主要包括腫瘤細胞遷徙、黏附，細胞外基質降解，腫瘤血管形成等〔7〕據世界衛生組織統計，男性主要惡性腫瘤有肺癌、肝癌、胃癌；女性主要惡性腫瘤有肺癌、胃癌、肝癌。國際癌癥研究機構調查顯示，癌癥死亡的最常見原因是肺癌(160萬例死亡)，肝癌(74.5萬例死亡)和胃癌(72.3萬例死亡)〔8〕。雖然說過去的100多年中胃癌不是致死率最高的癌癥，但其死亡率仍居于世界第二位〔9〕。

本研究基于胡桃醌處理的胃癌細胞，利用二代測序的技術，篩選胡桃醌處理的SGC-7901和對照組細胞的差異表達基因。差異程度最高的前5個上調基因與前5個下調基因被認為在胡桃醌處理后的胃癌細胞反應中可能發揮關鍵作用，顯著上調：TRIM39-RPP21、SPATC1、PCDH17、MMP2、ANGPT1；顯著下調：SPI1、GAGE12J、TNFSF12-TNFSF13、CSF3R、AC005154.6。此外，胃癌細胞對胡桃醌處理的反應與p53信號通路顯著相關。因此，進一步探究p53信號通路中的分子在該過程中的變化與作用機制對胡桃醌治療胃癌的臨床實踐有很大的意義。綜上，胡桃醌導致SGC-7901凋亡的機制可能是誘導細胞凋亡水平而發揮的，與調節凋亡相關基因p53表達相關，該研究為臨床上利用胡桃醌靶向抑制腫瘤細胞生長的方法提供了一定的科學依據。