姜黃素殼聚糖微球治療大鼠潰瘍性結腸炎

熊駿 廖鵬 吳映霖 游宇 黃媛華 黃國棟 余淑嬌

(1南昌大學醫學院，江西 南昌 330006；南昌大學第一附屬醫院 2中西醫結合科；3麻醉科；4消化科；5湖南中醫藥大學附屬衡陽醫院肛腸科；6南昌大學第一附屬醫院風濕免疫科)

潰瘍性結腸炎多表現為反復出現的腹痛、腹瀉、黏液膿血便，是一種慢性非特異性炎癥性疾病。在發病時多伴有部分腸外癥狀和全身癥狀。其特異性致病因素及發病機制尚不十分清楚，目前普遍認為，炎癥因子和抗炎因子的失衡導致潰瘍性結腸炎的發生。免疫異常是本病的重要因素，可能涉及多種細胞因子。當免疫功能正常時，許多細胞因子的分泌和活性處于動態平衡狀態〔1～5〕。研究認為潰瘍性結腸炎發病時，機體內各種細胞因子之間相互作用，促炎與抗炎細胞因子失衡，導致黏膜損傷〔6～8〕。研究中發現，白細胞介素(IL)-1β、IL-4和IL-6與潰瘍性結腸炎密切相關，同時這些細胞因子表達水平與核轉錄因子(NF)-κВ的激活密切相關〔9，10〕。本研究旨在探討姜黃素殼聚糖微球對潰瘍性結腸炎的治療作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性BALB/c大鼠120只，體重180～210 g，由長沙市開福區東創實驗動物部提供(SCXK湘2009-0012)，常規飼料喂養，喂養水為純凈水。

1.2藥物與試劑 5%葡聚糖硫酸鈉(DSS)購自北京諾特萊斯生物科技有限公司；大鼠抗人NF-κВ單克隆抗體、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP)二步法免疫組化檢測試劑盒(PV-6002)購自北京中杉金橋生物工程有限公司；IL-1β、IL-4、IL-6購自欣博康生物科技有限公司；美沙拉嗪腸溶片購自佳木斯鹿靈制藥有限責任公司(生產批號：H19980148)；姜黃素購自西安應化生物技術有限公司(生產批號：20100220)。

1.3造模方法 大鼠潰瘍性結腸炎模型采用5%DSS建立〔11〕：隨機取BALB/c大鼠100只，自由飲用5%DSS水溶液，同時分別灌胃給予干預藥物，0.2 ml/(10 g·體重)，1次/d，連續7 d后再飲用不含DSS的蒸餾水14 d。

1.4動物分組及藥物治療 將未經任何處理的20只大鼠設為空白對照組，正常飲水、飲食。將100只潰瘍性結腸炎大鼠隨機分為5組各20只。模型組：5%DSS自由飲水，正常飲食；陽性對照組：5%DSS自由飲水+含5 g/L柳氮磺胺吡啶的飼料喂養；殼聚糖微球組：5%DSS自由飲水+含15 g/L殼聚糖微球的飼料喂養；姜黃素組：5%DSS自由飲水+含20 g/L姜黃素的飼料喂養；姜黃素殼聚糖微球組：5%DSS自由飲水+含20 g/L姜黃素殼聚糖微球的飼料喂養。所有大鼠給藥4 w。

1.5標本采集 給藥4 w后股靜脈采血2 ml，取肛門上8 cm處的結腸組織用于檢測，治療結束后采用頸椎脫臼法處死。

1.6病理及免疫組化檢測 組織學損傷評分：參考Dieleman等〔10〕制定的標準，以結腸黏膜損傷點的長度作為結腸損傷分數方法。1分：≤0.5 mm；2分：>0.5 mm且≤1.0 mm；3分：>1.0 mm且≤2.0 mm；以此類推，損傷點寬度>2.0 mm時，分數加倍。疾病活動指數評分：參照Murano等〔12〕建立評估標準，每日監測體重、大便性狀及便血情況(采用聯苯胺法測定)。疾病活動指數(DIA)評分標準：體重無下降，糞便性狀正常，便檢隱血(-)計0分；體重下降>0且<5%，糞便性狀半稀，便檢隱血(+)計1分；體重下降≥5%且<10%，糞便性狀半稀，便檢隱血(+)計2分；體重下降≥10%且<15%，糞便性狀半稀，便檢隱血(+)計3分；體重下降≥15%，糞便性狀稀便，肉眼血便計4分。病理學檢測：剪取病變最明顯處結腸組織，常規病理切片并攝像，并對結腸標本行蘇木素-伊紅(HE)染色。免疫組化檢測：剪取距離肛門8～10 cm處的大鼠結腸組織用冷生理鹽水反復沖洗干凈，剪取肉眼所能看見的病變最明顯的一段潰瘍結腸黏膜，浸入4℃預冷的2.5%戊二醛進行前固定，再經1%鋨酸后固定，制備4 μm厚石蠟連續切片，待免疫組化檢測腸黏膜NF-κB表達，具體按MaxVisionTM試劑盒說明書進行。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清IL-1β、IL-6和IL-4的表達。

1.7統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1病理結果 模型組結腸黏膜遭嚴重破壞，部分有缺損，黏膜內腺體排列紊亂、變形。姜黃素殼聚糖微球組及姜黃素組病變較輕，黏膜較為完整。空白對照組結腸組織結構規則，腺體排列整齊。見圖1。

圖1 各組結腸組織病理(HE染色，×100)

2.2各組結腸損傷評分比較 治療4 w后，模型組、陽性對照組、殼聚糖微球組、姜黃素殼聚糖微球組和姜黃素組均表現為潰瘍形成，模型組損傷評分最高。姜黃素殼聚糖微球組與其他組相比，結腸黏膜組織學損傷評分顯著降低(P<0.01)。治療4 w后，模型組、殼聚糖微球組、姜黃素殼聚糖微球組和姜黃素組均表現為不同程度體重下降、便稀、便血，模型組疾病活動指數評分最高；姜黃素殼聚糖微球組與其他各組比較差異顯著(P<0.01)。見表1。

表1 各組結腸損傷及疾病活動指數評分比較分)

2.3各組NF-κB 、IL-1β、IL-4、IL-6水平比較 經4 w治療，姜黃素組和姜黃素殼聚糖微球組IL-4水平明顯高于模型組和陽性對照組(P<0.01)，而IL-1β、IL-6、NF-κB水平明顯低于模型組和陽性對照組(P<0.01)；姜黃素殼聚糖微球組與姜黃素組相比，血清IL-1β、IL-6、NF-κB含量明顯降低(P<0.01)，IL-4含量顯著升高(P<0.01)，見表2。

表2 治療后各組NF-κB 、IL-1β、IL-4、IL-6水平比較

3 討 論

姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的一種酚類物質，在傳統的中藥理論中具有抗炎、止痛，活血化瘀的功效，現代醫藥還發現姜黃素具有抗氧化、降血脂、抗凝、抗腫瘤及清除氧自由基等作用。研究表明，姜黃素具有抗炎癥性腸病的作用〔5～7〕。但由于姜黃素穩定性較差，在水中不易溶解，且體內代謝半衰期較短，故不易制備成片劑、膠囊劑或注射劑等劑型，大大限制了其臨床應用。

藥物緩釋體系是近年來藥物研究最熱門的領域之一。在藥物控釋技術方面，需要藥物分子與藥物載體按照一定的物理或化學方式相結合，通過特殊的藥物制劑工藝和技術，使藥物按要求釋放以達到更好的治療效果。實現藥物的裝載方式主要有物理吸附、物理包封、化學耦聯〔8,9〕。物理包封過程中，載體的交聯程度是影響藥物釋放的關鍵因素之一。目前研究較多的是可降解微球和水凝膠兩種載藥方式〔10,11〕。微球是指用高分子生物材料將藥物包裹形成的直徑為幾微米到幾百微米的微小球狀實體。交聯度不同的載藥微球，藥物的釋放率有所差異，這表現在交聯度高的微球載體表現為延時緩釋，而交聯度低的表現為暴釋。同一種藥物裝載于不同的載體，由于載體結構間的差異，與藥物間的作用方式的不同，會影響藥物的緩釋能力及藥物作用于病灶的功效。與此同時單純的殼聚糖微球在潰瘍性結腸炎的治療中也起到了一定的抑制炎癥反應的作用，有相關文獻也表明，殼聚糖對結腸炎的改善作用可能是通過抑制 NF-κB 通路減少炎性細胞因子的釋放起作用〔13〕，因此，用殼聚糖微球制成的姜黃素殼聚糖在治療潰瘍性結腸炎方面效果更好，其作用機制可能是姜黃素殼聚糖微球通過抑制NF-κВ的表達，減輕炎癥反應，通過抗炎作用達到減輕潰瘍性結腸炎中結腸組織損傷的效果。