長鏈非編碼RNA PCGEM1靶向miR-433-3p調控結直腸癌細胞增殖、遷移及侵襲的分子機制

楊艷 張曉潔 馬艷青 韓雨 魏海波 張梅

(1赤峰市醫院腫瘤內三科，內蒙古 赤峰市 024000；2赤峰學院第二附屬醫院腫瘤科)

近年來，結直腸癌發病率和致死率呈上升趨勢〔1〕。外科根治性切除手術是結直腸癌臨床治療的主要方法，手術后癌細胞的復發轉移是手術失敗的主要原因〔2〕，研究癌細胞增殖、轉移的機制對控制結直腸癌具有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)被證實在癌癥組織中影響癌細胞的凋亡、增殖、分化等多個生物過程，是分子靶向治療癌癥的一個新目標〔3～5〕。lncRNA PCGEM1是前列腺特異性基因，在前列腺癌組織中異常高表達，可誘導前列腺癌細胞的增殖和遷移〔6〕。眾多研究表明，PCGEM1在上皮性卵巢癌〔7〕、前列腺癌〔8～10〕、胰腺癌〔11〕、骨關節滑膜炎〔9〕(OA)組織中都存在異常表達，參與腫瘤的發生和發展。miRNA發現于1993年〔12〕，是長19～22個核苷酸的非編碼RNA，參與多種病理生理過程的調控，人體內miRNA的異常表達與多種疾病的發生密切相關，特別是在惡性腫瘤的發生、腫瘤的生長和轉移中起重要作用〔13〕。miR-433在人類腫瘤發生和發展中發揮多種作用。miR-433在膀胱癌〔14〕、肝癌〔15〕細胞的侵襲和遷移中起重要作用；miR-433-3p能夠抑制食管鱗狀細胞癌ESCC〔16〕和人膠質瘤細胞〔17〕的增殖、遷移和侵襲。然而PCGEM1和miR-433-3p在結直腸癌中的表達和作用尚未可知。本研究以結直腸癌HT-29細胞為研究對象，探討PCGEM1影響HT-29細胞增殖、侵襲和遷移的分子機制，為結直腸癌的術后分子靶向治療提供新靶標。

1 材料與方法

1.1材料 人結直腸癌細胞株HT-29和人正常結腸黏膜上皮細胞株NCM460購自ATCC；胎牛血清(FBS)和RPMI1640培養基購自Gibco公司，牛血清白蛋白(BSA)、四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞礬(DMSO)和胰蛋白酶Trypsin購自Sigma-Aldrich公司；Transwell板購自美國Corning公司；雙熒光素酶報告系統購自美國Promega公司；Lipofectamine 2000轉染試劑、總RNA提取試劑盒、 real-time PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒(RT-PCR)購自美國Invitrogen公司；光學顯微鏡、全自動酶標儀及real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2細胞培養 配制細胞培養液：10% FBS+RPMI1640培養基+1×105U/L 青霉素+100 mg/L 鏈霉素，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。待細胞生長至對數生長期時，洗滌消化傳代。

1.3細胞轉染 培養HT-29細胞至對數生長期，用細胞培養液稀釋細胞濃度至1×106個/ml，200 μl/孔接種于6孔板中，細胞培養至基本融合為一層時按照Lipofectamine 2000說明書進行轉染。先用無血清OptiMEM培養液稀釋Lipofectamine 2000、si-NC、si-PCGEM1、miR-NC、miR-433-3p、pcDNA、pcDNA-PCGEM、si-PCGEM1+anti-miR-NC、si-PCGEM1+anti-miR-433-3p、WT-PCGEM1+miR-NC、WT-PCGEM1+miR-433-3p、MUT-PCGEM1+miR-NC和MUT-PCGEM1+miR-433-3p的載體，之后取等體積Lipofectamine 2000和各組載體混合，輕柔混勻后室溫孵育20 min，將混合液滴入到培養好的細胞孔板中，邊滴加邊輕輕晃動培養板，混合均勻后置培養箱中培養，培養6 h后換成完全培養基，轉染48 h后收集細胞進行后續實驗。

1.4real-time PCR檢測mRNA表達 收集轉染后培養48 h的各組HT-29細胞，用試劑盒提取總RNA，測定濃度和純度，保存于-80℃。然后按照RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA，反應程序為16℃ 30 min、42℃ 45 min、72℃ 5 min；4℃放置10 min，合成的cDNA測定濃度和純度后置于-80℃保存。取cDNA按照 real-time PCR的說明書進行反應，反應程序為：95℃ 6 min；95℃ 45 s、58℃ 40 s、72℃ 45 s，35個循環；72℃ 5 min。運用IQ5TM real-time PCR Detection System(Bio-Rad)進行數據分析。

1.5MTT實驗測定細胞活性 將轉染后的各組HT-29細胞進行收集，Trypsin消化后，調整細胞濃度至3×103個/孔接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，分別在24、48、72 h 3個時間點時進行 MTT 實驗，每孔加入 20 μl(5 mg/ml)MTT，置培養箱繼續培養4 h，棄去上清培養液，每孔加入150 μl DMSO溶解結晶，室溫振蕩5 min，酶標儀測定OD 490 nm 處的吸光度(A)值。

1.6Transwell實驗測定細胞遷移和侵襲 遷移實驗：轉染后各組HT-29細胞培養至對數生長期，收集細胞加入含1%FBS的RPMI1640培養基，培養12～24 h，用胰蛋白酶消化細胞，離心收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入含10 g/L BSA的無血清RPMI1640培養基，調整細胞密度為1×105個/ml。Transwell下層培養孔加入500 μl 10%FBS培養基作為遷移趨化物，取100 μl細胞加入Transwell上層小室，再將上層小室放入下層培養孔中，置CO2培養箱培養48 h，取出用棉簽拭去基質膠和上層小室的細胞，甲醛固定后結晶紫染色，顯微鏡觀察計數下層細胞，每個樣本計數10個視野，取平均值。

侵襲實驗：將Matrigel從-20℃取出置于4℃冰箱融化，以4℃無血清培養基1∶3比例稀釋Matrigel，加入上層Transwell小室，37℃ 3 h烘干，以下步驟同遷移實驗，上層小室加入100 μl細胞，下層加入500 μl 10%FBS培養基，培養48 h，甲醛固定細胞，結晶紫染色，計數。

1.7雙熒光素酶報告系統驗證PCGEM1轉錄活性 將HT-29細胞轉染后進行胰蛋白酶消化，計數，以2×104個細胞/孔接種于24孔板中,置于37℃ 5%CO2培養箱中培養24 h，觀察若細胞融為一層，則按照Lipofectamine 2000說明書進行轉染，分別構建PCGEM1野生型(WT-PCGEM1)和突變型(MUT-PCGEM1)雙熒光素酶報告載體，分別共轉染miR-NC或miR-433-3p，轉染后培養48 h，收集細胞，加入配制好的裂解緩沖液，室溫靜置裂解20 min，離心收集上清，-20℃保存或直接檢測。檢測熒光素酶活性，加入熒光素酶底物，發光儀檢測上清中熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.8統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1PCGEM1和miR-433-3p在HT-29細胞和NCM460細胞中的表達 qRT-PCR結果表明，與正常對照NCM460細胞相比，結直腸癌細胞HT-29中PCGEM1表達量顯著升高(P<0.05)，miR-433-3p表達顯著下降(P<0.05)，見表1。

表1 PCGEM1和miR-433-3p在HT-29細胞和NCM460細胞中的表達

2.2抑制PCGEM1表達可抑制結直腸癌HT-29細胞增殖 qRT-PCR結果表明，與si-NC組相比，si-PCGEM1組PCGEM1表達顯著下降(P<0.05)。MTT實驗結果表明，與si-NC組相比，si-PCGEM1組細胞活性(OD 490 nm)在48、72 h顯著下降(P<0.05)，見表2。

表2 抑制PCGEM1表達對結直腸癌HT-29細胞增殖的影響

2.3抑制PCGEM1表達可抑制結直腸癌HT-29細胞遷移、侵襲的影響 Transwell實驗結果顯示，與si-NC組相比，si-PCGEM1組遷移細胞數和侵襲細胞數顯著下降(P<0.05)，見圖1，表3。

圖1 抑制PCGEM1表達對結直腸癌HT-29細胞遷移、侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

表3 抑制PCGEM1表達對結直腸癌HT-29細胞遷移、襲的影響個)

2.4過表達miR-433-3p可抑制結直腸癌HT-29細胞增殖、遷移、侵襲 qRT-PCR結果表明，與miR-NC組相比，miR-433-3p組miR-433-3p表達量顯著上升(P<0.05)。MTT實驗和Transwell實驗結果顯示，與miR-NC組相比，miR-433-3p組HT-29細胞活性在48、72 h時顯著降低(P<0.05)，遷移細胞數和侵襲細胞數顯著下降(P<0.05)，見表4。

表4 過表達miR-433-3p對結直腸癌HT-29細胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.5PCGEM1負向調控miR-433-3p的表達 Targetscan軟件預測結果顯示，PCGEM1的序列中含有與miR-433-3p互補的核苷酸序列，見圖2。雙熒光素酶報告系統結果顯示，與miR-NC組相比，miR-433-3p組WT-PCGEM1的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)；而MUT-PCGEM1沒有明顯變化(P>0.05)，見表5。qRT-PCR結果發現，與si-NC組(0.58±0.06)相比，si-PCGEM1組miR-433-3p表達量(1.17±0.12)顯著上升(P<0.05)；與pcDNA組(0.63±0.06)相比，pcDNA-PCGEM1組miR-433-3p表達量(0.32±0.03)顯著下降(P<0.05)。

圖2 PCGEM1序列中含有與miR-433-3p互補的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.6抑制miR-433-3p表達逆轉了下調PCGEM1表達對HT-29細胞增殖、遷移、侵襲的作用 MTT結果顯示，在48 h和72 h時，與si-NC組相比，si-PCGEM1組細胞活性顯著下降(P<0.05)；與si-PCGEM1+anti-miR-NC相比，si-PCGEM1+anti-miR-433-3p組細胞活性顯著上升(P<0.05)。Transwell實驗結果顯示，與si-NC組相比，si-PCGEM1組遷移和侵襲細胞數顯著下降(P<0.05)；與si-PCGEM1+anti-miR-NC組相比，si-PCGEM1+anti-miR-433-3p組遷移和侵襲細胞數顯著上升(P<0.05)。見表6。

表6 抑制miR-433-3p表達逆轉了下調PCGEM1表達對HT-29細胞增殖、遷移、侵襲的作用

3 討 論

隨著經濟條件的提升，人們的飲食結構發生變化，導致結直腸癌發病率不斷上升〔18〕，而結直腸癌患者術后腫瘤復發轉移是導致預后不良和死亡率上升的主要原因。大量研究表明，lncRNA和miRNA在結直腸癌的發生和轉移起重要作用〔19,20〕。

lncRNA PCGEM1在多種癌組織中出現異常表達，與癌細胞的侵襲和遷移有關。研究發現，lncRNA PCGEM1在前列腺癌組織中過量表達，與前列腺癌細胞的增殖和遷移密切相關〔6，8,10〕。Shuo等〔7〕研究表明，PCGEM1可能通過上調RHoA的表達誘導上皮性卵巢癌腫瘤發生和發展。徐岷等〔11〕研究發現，PCGEM1在胰腺癌組織中表達水平高于癌旁組織，抑制PCGEM1表達可降低癌細胞的侵襲和遷移能力。但尚未有研究闡述PCGEM1是否影響結直腸癌細胞的增殖和遷移。本研究結果提示，抑制PCGEM1表達可以抑制HT-29細胞增殖、侵襲和遷移的能力。且驗證了PCGEM1在多種癌細胞和組織中表達量被顯著上調，促進癌細胞的增殖、侵襲和遷移的結論。

miR433與多種癌癥的增殖、遷移和侵襲有關。Xu等〔14〕研究表明miR-433在膀胱癌中被下調，過表達miR-433則會通過調控下游靶基因c-Met 和CREB1抑制EMT通路，從而抑制癌細胞的侵襲和遷移。Yang等〔15〕發現，miR-433通過抑制CREB13'-UTR 活性和蛋白表達抑制肝癌細胞的遷移。Shi等〔16〕研究發現，miR-433-3p通過抑制GRB2基因表達抑制食管鱗狀細胞癌ESCC的增殖、遷移和侵襲。Sun等〔17〕發現，miR-433-3p通過靶向調控CREB抑制人膠質瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，誘導細胞凋亡，同時提高人膠質瘤對替莫唑胺的化學敏感性。但miR-433-3p在結直腸癌中尚未被研究，本研究首次闡述了miR-433-3p對結直腸癌的作用，過表達miR-433-3p可抑制結直腸癌HT-29細胞增殖、遷移、侵襲，抑制miR-433-3p表達逆轉了下調PCGEM1表達對HT-29細胞增殖、遷移、侵襲的作用，同樣說明miR-433-3p在多種癌細胞的侵襲遷移中起重要調節作用。

綜上，PCGEM1在HT-29細胞中參與負向調控miR-433-3p的表達，PCGEM1通過下調miR-433-3p表達促進結直腸癌HT-29細胞增殖、遷移和侵襲。PCGEM1可作為結直腸癌分子靶向治療新的研究方向。