miR-183靶向DDR1調控乳腺癌細胞遷移侵襲的分子機制

朱明珍 許瑾 徐靜 徐海燕 李秀翠 李德凡 邵華

(1連云港市第二人民醫院腫瘤科，江蘇 連云港 222000； 2南京醫科大學康達學院基礎醫學部；3連云港市第二人民醫院甲乳外科)

乳腺癌是世界上最常見的女性惡性腫瘤之一，居世界女性癌癥死亡率第二位〔1〕。調查顯示，中國女性乳腺癌的發病率和死亡率均呈上升趨勢，其增長速度遠高于發達國家〔2〕。乳腺癌晚期極易發生肝肺轉移，預后極差〔3〕。因此，精準靶向治療的研究對乳腺癌患者具有重大意義。miRNA為內源性短鏈非編碼小RNA，其長度為19～23個核苷酸，參與細胞的生物學過程，調控細胞內穩態及各種信號通路〔4〕。研究證實，miRNA參與各種癌癥的惡性進程，發揮抑癌或促癌作用〔5〕。miR-183在多種癌癥中均出現異常表達，包括乳腺癌〔6〕。但miR-183在乳腺癌中的作用機制尚未十分清楚。盤狀結構域受體(DDRs)包括DDR1、DDR2，在細胞增殖、黏附及基質重塑中具有重要作用〔7〕，尤其腫瘤細胞〔8〕。DDR1在多種癌癥中均具有促進轉移的作用，但其在乳腺癌中的作用機制尚未完全清楚。本研究旨在探討miR-183在乳腺癌細胞中的功能及潛在機制。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌細胞MDA-MB-231、正常細胞MCF-10A均購自美國菌種保藏中心(ATCC)；胎牛血清購自美國GIBCO公司；LipofectamineTM2000購自北京宜科思源科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自上海睿時生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自日本Takara公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自Millipor； ECL發光液購自北京康為世紀；RIPA蛋白裂解液購自碧云天生物技術公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京原平皓生物公司。

1.2細胞培養 人乳腺癌細胞MDA-MB-231、正常細胞MCF-10A培養時使用DMEM培養基(含10%胎牛血清)在37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中進行常規培養。

1.3細胞轉染 取對數增殖期的MDA-MB-231、MCF-10A細胞標記為MDA-MB-231組、MCF-10A組。用3倍量的脂質體將miR-183 mimics、miR-con、si-DDR1、si-con、miR-183+pcDNA、miR-183+pcDNA-DDR1轉染至MDA-MB-231細胞，轉染48 h后，通過實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測轉染效率，確認轉染成功后才可標記為miR-183組、miR-con組、si-TCF7組、si-con組，miR-183+pcDNA組、miR-183+pcDNA-DDR1組用于后續試驗。若未達到理想的轉染效果，則更換轉染條件或質粒、DNA，再次進行轉染，直至達到理想轉染效率為止。

1.4qRT-PCR實驗 取對數增殖期的各組細胞，按照RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑盒提取RNA并將其合成cDNA。用qRT-PCR試劑盒檢測分析miR-183、DDR1的表達。結果用2-△△Ct計算miR-183、DDR1的表達。引物信息(5'-3')：miR-183上游引物：CGGTATGGCACTGGTAGAATTCACT；下游引物：GCTTTCCAATGCACTGACCATT；DDR1上游引物：ACTTTGGCATGAGCCGGAAC；下游引物：ACGTCACTCGCAGTCGTGAAC；內參U6和GAPDH的引物為通用引物。

1.5MTT實驗 取對數增殖期的待檢細胞，用培養基調整至105個/ml。取100 μl置于96孔板，再加入20 μl MTT溶液，孵育3 h后，再加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，將結晶充分溶解，在酶標儀吸收光490 nm波長下檢測吸光度(A)。

1.6Western印跡實驗 取對數增殖期的待檢測細胞，加入蛋白裂解液充分裂解，提取總蛋白。12 000 r/min離心10 min，取上清稀釋后進行沸水浴變性。用變性后的蛋白上清液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，4～5 h電泳結束。將膠上的蛋白在低溫下用轉膜儀轉移至PVDF膜上。結束后用2.5%脫脂奶粉室溫下封閉處理2 h。將膜用Ⅰ抗稀釋液在4℃條件下孵育過夜。再將膜轉移至Ⅱ抗稀釋溶液中37℃條件下孵育2 h。最后用ECL發光試劑盒進行顯影曝光。用目的蛋白灰度值與內參β-actin灰度值的比值表達蛋白的表示情況。

1.7Transwell實驗 取對數期需要檢測的細胞，用不含血清的培養基進行饑餓培養12 h，調整至105個/孔，取100 μl細胞均勻涂抹到小室的上室內，下室內加入700 μl含血清細胞培養基，培養過夜。次日，取出小室，用棉簽輕輕拭去殘余的細胞。將膜用甲醇固定、0.1%結晶紫染色，最后進行封片。注意封片是需要將膜的下表面向上。顯微鏡下觀察小室下表面附著的細胞數，并計數，取平均值。注意：檢測細胞遷移用的是不含基質膠的Transwell小室，而檢測細胞侵襲用的是含有基質膠的Transwell小室。細胞的侵襲檢測在操作步驟上完全相同，僅存在選用小室的差異。

1.8雙熒光素酶報告基因檢測實驗 通過Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)預測DDR1與miR-183的結合位點，根據結合位點設計DDR1-3'UTR WT和DDR1-3'UTR MUT，將其克隆至熒光載體psiCHECK2上，構建熒光素酶報告質粒載體。再將其與miR-NC、miR-183共轉染至MDA-MB-231細胞。按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書要求操作。記錄海腎熒光素酶活性和螢火蟲熒光素酶活性。結果以海腎熒光素酶的發光強度與螢火蟲熒光素酶發光強度的比值反映miR-183與DDR1的結合力。

1.9統計學處理 采用PEMS3.2軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1miR-183、DDR1在乳腺癌細胞MDA-MB-231中的表達 與MCF-10A組相比，MDA-MB-231組miR-183表達顯著降低，DDR1 mRNA和DDR1 蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 乳腺癌細胞MDA-MB-231和正常細胞MCF-10A中DDR1的表達

表1 乳腺癌細胞MDA-MB-231和正常細胞MCF-10A中miR-183和DDR1的表達

2.2過表達miR-183抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖 與miR-con組相比，miR-183組MDA-MB-231細胞在48、72 h時細胞活性均顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 培養各時間點過表達miR-183抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖

2.3過表達miR-183抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的遷移和侵襲 與miR-con組相比，miR-183組MDA-MB-231細胞遷移量和侵襲量均顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 過表達miR-183抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的遷移和侵襲個)

2.4miR-183靶向DDR1 運用miRcode數據庫預測到miR-183與DDR1 3'UTR存在結合位點(圖2)；與miR-con組相比，miR-183組WT-DDR1細胞中熒光活性顯著降低(表4)；miR-183能夠負向調控細胞中DDR1的表達水平(P<0.05)，其中miR-con組DDR1蛋白表達為1.05±0.08，miR-183組為0.33±0.06,anti-miR-con組為1.02±0.07，anti-miR-183組為1.54±0.11，見圖2。

1～4：miR-con組；miR-183組；anti-miR-con組；anti-miR-183組圖2 miR-183靶向DDR1 mRNA的3'UTR

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5敲減DDR1抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖、遷移和侵襲 與si-con組相比，si-DDR1組MDA-MB-231細胞DDR1蛋白表達顯著降低，在48、72 h時細胞活性顯著降低，細胞遷移量和侵襲量顯著降低(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 檢測乳腺癌細胞MDA-MB-231中DDR1的表達

表5 培養各時間點敲減DDR1抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖、遷移和侵襲

2.6過表達DDR1和過表達miR-183對乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-con組相比，miR-183組MDA-MB-231細胞DDR1蛋白表達顯著降低，在48、72 h時細胞活性顯著降低，細胞遷移量和侵襲量顯著降低(P<0.05)；與miR-183+pcDNA組相比，miR-183 pcDNA-DDR1組DDR1蛋白表達量顯著升高，在48、72 h時細胞活性顯著升高，細胞遷移量和侵襲量顯著升高(P<0.05)。見圖4，表6。

1～4：miR-con組;miR-183組;miR-183+pcDNA組;miR-183+pcDNA-DDR1組圖4 檢測乳腺癌細胞MDA-MB-231中DDR1的表達

表6 培養各時間點過表達DDR1和過表達miR-183對乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

miRNA參與基本細胞功能的調節使其成為癌癥研究的前沿，在人類許多惡性腫瘤(包括乳腺癌)中失調，表明其可能作為新型癌基因或抑癌基因參與癌癥的發生發展〔9,10〕。差異表達的miRNA鑒定及其功能作用的闡明可提供針對腫瘤發生的復雜分子機制的依據〔11〕。miR-183位于染色體7q32上，是miRNA家族的一部分，在許多癌癥中異常表達〔12〕。Luo等〔13〕研究發現，乳腺癌細胞中有11種差異表達的miRNA，其中表達異常降低的miRNA包括miR-183，推測miR-183在乳腺癌中具有調控作用。吳正升等〔14〕闡明，miR-183在乳腺癌中表達異常降低，且過表達miR-183可上調乳腺癌細胞侵襲力，下調遷移力，對細胞活性變化不明顯，提示miR-183可能參與了乳腺癌細胞的惡性過程。Lowery等〔15〕報道，miR-183在乳腺癌中表達異常降低，且miR-183過表達可抑制乳腺癌細胞的遷移侵襲，此外，miR-183靶向下調埃茲蛋白(Ezrin)，表明miR-183靶向VIL2在乳腺癌遷移和轉移的調節中起重要作用。本研究發現乳腺癌細胞中miR-183異常降低，且過表達miR-183可抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，與上述研究觀點相符合〔13～15〕；深入研究發現，miR-183靶向負調控DDR1的表達，可能與miR-183在乳腺癌中的功能具有相關性。

DDR1也屬于一類膠原受體，其在多種腫瘤中表達異常升高〔16〕，參與腫瘤細胞的EMT化，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲〔17〕。有研究報道，DDR1在乳腺癌、肝癌、肺癌中均具有促進癌癥進一步惡化的作用〔18～20〕。Toy等〔21〕研究發現，DDR1在乳腺癌組織中高度表達，且定位于上皮-基質界面處，還與乳腺癌的分級和預后相關，推測DDR1在乳腺癌中具致癌作用。楊婷等〔22,23〕研究表明，DDR1可促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲，且其受miR-199a的負向調控抑制小鼠乳腺癌的轉移。Anhao等〔24〕在三陰性乳腺癌的研究中運用Western印跡和熒光素酶報告分析發現，miR-199b-5p可靶向抑制DDR1的表達進而抑制三陰性乳腺癌的增殖、遷移和侵襲。本研究發現人乳腺癌細胞中DDR1的表達異常升高，且敲減DDR1可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲；深入研究還發現，過表達DDR1可逆轉過表達miR-183對乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用，說明DDR1能夠恢復miR-183在乳腺癌中的功能。不足之處在于這些實驗結果并未在動物體內得到進一步驗證。

綜上，miR-183能夠抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其機制之一可能為靶向DDR1，為乳腺癌的精準治療奠定基礎。