氨水-氫氧化鉀復合預處理提高菌糠厭氧消化性能的研究

黃文博，袁海榮，李秀金

(北京化工大學 環境科學與工程系，北京 100029)

Pleurotusostreatus(糙皮側耳，平菇)是栽培范圍最廣、產量最大的食用菌之一，能夠以秸稈為原料進行栽培。P.ostreatus栽培結束后產生的大量廢棄物稱為菌糠(spent mushroom substrate, SMS)。2018年我國菌糠產量為1300萬噸[1]。菌糠中殘留的木質纖維素組分依然具有很高的甲烷轉化潛力，但由于子實體生長過程改變了秸稈中木質纖維素組分的化學結構和含量，菌糠的厭氧消化性能仍需要進一步研究。

近年來，國內外對菌糠厭氧消化的研究主要針對菌糠與其他生物質進行聯合厭氧消化。楊麗英[2]等對奶酪乳清、牛糞和菌渣3種底物進行共厭氧消化產甲烷性能的研究，發現添加牛糞或同時添加牛糞和奶酪乳清均能提高菌糠的產甲烷性能。Luo[3]等采用3種菌糠與牛糞進行聯合厭氧消化，相較菌糠單獨厭氧消化，共消化甲烷產率提高6%～61%。由此可見，菌糠具有產甲烷潛力，但作為單一底物厭氧消化時，栽培過程的結構改變和組分降解影響了其厭氧消化性能。有研究認為，菌絲對秸稈的滲透以及其分泌的胞外聚合物對秸稈的附著也會抑制厭氧消化過程水解酶對菌糠中纖維素的作用[4-5]，影響菌糠甲烷轉化。堿預處理已被證明能夠去除秸稈中木質素，促進碳水化合物與木質素的分離，水解半纖維素，降低纖維素聚合度和結晶度[6]。Li[7]等采用堿性過氧化氫(AHP)預處理玉米秸稈，木質素去除率達到91.53%，葡萄糖酶水解得率提高至88.34%。Castro[8]等使用溫和堿處理方式(50℃～70℃，20～80 mg NaOH·g-1秸稈)處理稻草，能夠有效去除木質素乙?；咸烟敲杆獾寐侍岣?3%～89%。Liu[9]等試驗發現，低溫堿法預處理能夠有效去除菌糠中殘留木質素(67.6%)，提高酶水解效率(85.6%)，使葡萄糖產率提升。由此可見，堿預處理也能夠對菌糠中的木質素進一步去除，水解其中的纖維素，提高厭氧微生物對菌糠的可利用性。

因此，本實驗采用氨水-氫氧化鉀復合預處理方式對菌糠進行預處理，提高其厭氧消產氣性能。并對預處理過程對菌糠的改性機制進行機理分析，確定菌糠性質、酶水解性能以及厭氧消化性能之間的聯系，為菌糠厭氧消化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與接種物

實驗所用菌糠為實驗室中使用稻草、玉米秸和麥秸為原料，進行45天P.ostreatus栽培后所得相應菌糠。接種物為北京順義區以豬糞為原料，穩定運行的中溫沼氣站消化殘余物。接種物取回后靜置沉淀，去除上層清液后備用。原料和接種物基本性質示于表1中。

表1 菌糠及接種物基本性質*

1.1.2 處理試劑

實驗所采用的處理試劑為分析純的氫氧化鉀(KOH)和氨水(NH3·H2O)(濃度25%)。

1.2 實驗方法

1.2.1 氨水-氫氧化鉀(氨-鉀)復合預處理

本實驗綜合所在實驗室之前的研究及文獻中所得結論[10]，將氫氧化鉀和氨水配按不同濃度制成2種混合溶液作為處理試劑。其中，氫氧化鉀添加量分別為菌糠干重(以TS計)的2%或4%，氨水添加量(以NH3分子計)為菌糠干重(以TS計)的2%，添加水量為菌糠干重(以TS計)的6倍。兩種混合溶液濃度分別計作2%NH3+2%KOH和2%NH3+4%KOH。將預處理試劑添加到菌糠中混合均勻，置于35℃生化培養箱內密封處理3天。

1.2.2 酶水解

對預處理前后菌糠的纖維素酶水解能力進行測定，以此表征其在厭氧消化過程中對微生物產生的纖維素降解酶的抗性、可及性及反應性。

1.2.3 厭氧消化

氨-鉀復合預處理3種菌糠分別作為厭氧消化原料，對照組為相應的未經預處理菌糠，接種污泥為空白(其產氣量在厭氧消化后被扣除)。厭氧消化實驗采用1 L藍蓋瓶，工作體積800 mL。秸稈有機負荷為50 gTS·L-1，接種污泥有機負荷為15 gMLSS·L-1，pH值為7.0±0.2。35℃±2℃厭氧消化45天。實驗組與對照組均設3重復。

1.3 分析方法

1.3.1 基本性質

總固體含量(TS)、揮發性固體含量(VS)、懸浮固體濃度(MLSS)以及溶解性化學需氧量(SCOD)根據American Public Health Association (APHA)中推薦的方法進行[11]。有機元素含量(TC，TH，TO及TN)采用元素分析儀(Vario EL/micro cube elemental analyzer, Germany)進行測定。pH值采用Thermo Orion 3-Star型pH計測定。木質纖維素含量采用全自動纖維分析儀(ANKOM 2000I)測定。揮發性脂肪酸(VFAs)產率(包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸)采用氣相色譜(島津，GC2014)測定(DB-WAX123-7032毛細管柱，FID檢測器)。厭氧消化過程產氣量采用排水法測定(標況下計算)；所得氣體組分含量采用氣相色譜(北分，SP-2100A)測定(TDX-01填充柱，TCD檢測器)。

1.3.2 菌糠結構測定

傅里葉變換紅外光譜分析(FTIR)采用KBr壓片法，通過傅立葉變換紅外光譜儀(Nicolet 6700)測定樣品的紅外光譜。

X射線衍射分析使用X射線衍射儀(XRD, Rigaku 2500VB2+PC)，掃面范圍5°～90°，纖維素結晶度由式(1)計算[4]：

CrI=I002-Iam/I002×100

(1)

式中：I002是2θ=22.8°時的最大衍射強度；Iam是2θ=18.4°時的最小衍射強度。

1.3.3 菌糠酶水解能力測定

纖維素酶水解率的測定方式參考Corrêa等所用方法[12,13]，計算方法如式(2)所示：

葡萄糖得率(%)=葡萄糖含量×0.9/秸稈中纖維素含量×100

(2)

菌糠對纖維素酶的抗性以及纖維素酶在秸稈上的反應速率變化可以通過兩種動力學模型進行分析，如式(3)和(4)[14]所示：

Y=A×ln(1+B×t)

(3)

Y=p×(t/K+t)

(4)

式中：Y為不同水解時間所得糖化率，%；t為水解時間，h；k=1/A，為速率常數；v0=A×B，為水解率，%·h-1；P為菌糠初始纖維素含量，%；K為達到最大纖維素水解量一半所需時間，h。

1.3.4 厭氧消化動力學分析

BMP甲烷產率可進行一級動力學擬合分析厭氧消化產氣性能[15]，擬合方程如式(5)所示。

BMP(t)=BMPmax{1-exp[-k(t-θ)]}

(5)

式中(以VS計)：BMP(t)為甲烷產率，mL·g-1;BMPmax為最大產甲烷潛力，mL·g-1；k為甲烷轉化速率常數，mL·g-1d-1；θ為延滯期，d。

菌糠中有機組分采用概化分子式CnHaOb表示[15]。理論甲烷產量是當底物完全轉化成甲烷時的最大體積(標況)。菌糠的理論甲烷產量和生物降解性可由式(6)和式(7)得到。

(6)

BD=BMPexp/BMP0×100%

(7)

式中(以VS計)：BD為生物降解性，%；BMP0為理論甲烷產率，mL·g-1；BMPexp為實驗所得甲烷產率，mL·g-1。

2 結果與討論

2.1 氨-鉀復合預處理效果研究

2.1.1 可溶性物質變化

厭氧消化理論表明，水解速率會直接影響后續酸化、甲烷化階段的進行，是厭氧消化的主要限制因素[16]。因此，對氨-鉀復合預處理前后菌糠可溶性組分含量變化進行測定，分析預處理對菌糠水解性能的影響。

SCOD反映可溶性有機物含量。如表2所示，3種菌糠未處理時SCOD含量較低，表明菌糠所含可溶性有機物較少，在厭氧消化初始階段可水解性較低。經2%NH3+2%KOH和2%NH3+4%KOH預處理后，菌糠預處理浸出液中SCOD含量分別可提升19.8%～47.4%和36.7%～50.4%。表明預處理能夠提高菌糠中有機物的降解，且隨KOH濃度的提升，作用更顯著。其中，2%NH3+4%KOH預處理玉米秸菌糠SCOD最高，預處理試劑對其作用最明顯。

還原糖是水解過程中微生物能夠直接利用的可發酵糖，能夠在酸化階段直接轉化為丙酮酸，進而轉化為VFAs后成為產氫產乙酸化階段底物。由表2可以看出，預處理能夠提高菌糠還原糖的溶出，2%NH3+2%KOH能夠使還原糖溶出量提高至未處理的1.7～2.4倍，而2%NH3+4%KOH能進一步將溶出量提高至未處理的1.9～2.6倍。原料性質可以看出，3種菌糠中仍有較高的半纖維素和纖維素含量，但未處理時還原糖溶出較低。預處理后其還原糖溶出量明顯提升，2%NH3+4%KOH預處理玉米秸菌糠還原糖含量最高，證明氨-鉀復合預處理對菌糠中纖維素、半纖維素能起到預水解作用，進而提高厭氧消化產氣性能。

表2 預處理前后菌糠性質*

VFAs濃度的提高可以在一定程度上增加產氫產乙酸階段的底物濃度，促進反應正向進行。由于預處理是在35℃進行3天反應，使得溶出物中有VFAs產生，相較未處理組有明顯提升，且隨著KOH濃度提高，VFAs產生越多(2%NH3+2%KOH提高至未處理的4.1～4.5倍，2%NH3+4%KOH提高至未處理的5.3～5.7倍。)，2%NH3+4%KOH預處理玉米秸菌糠VFAs含量最高，表明其在厭氧消化初始階段可提供更多的甲烷轉化底物。但VFAs含量并未高于13000 mg·L-1，因此不會在厭氧消化初始階段對產甲烷菌造成抑制作用，不會破壞系統的穩定性[10]。此外，對預處理后菌糠浸出體系pH值進行測定，發現盡管體系VFAs含量提高，但系統pH值仍維持在7以上，呈弱堿性，表明由于NH3的添加，提高了體系的緩沖性，小分子有機酸可能是以其銨鹽形式存在，對厭氧消化系統穩定性影響較小。

2.1.2 結構變化

本實驗采用FTIR和XRD分析來研究氨-鉀復合預處理對菌糠結構的影響(其中，2N+2K和2N+4K表示預處理試劑濃度，RSMS、CSMS和WSMS表示稻草、玉米秸和麥秸3種菌糠)。由圖1～圖3可以看出，氨-鉀復合預處理后，波數1729 cm-1和1515 cm-1處吸收峰消失；1166 cm-1處吸收峰明顯減弱，表明菌糠木質素骨架結構以及與半纖維素之間的連接結構被破壞，部分半纖維素被降解。但1456 cm-1處吸收峰降解不明顯，且1322 cm-1和1635 cm-1處吸收有所增加，表明菌糠中殘留木質素的單體結構依然存在，且在骨架斷裂并且與半纖維素分離后更多的暴露出來。此外，1048 cm-1和1376 cm-1處吸收峰的減少表明纖維素與半纖維素之間的連接也發生斷裂，部分纖維素結晶區降解。由于堿對半纖維素的溶解作用顯著，可以推斷氨-鉀復合預處理主要是通過對菌糠中殘留半纖維素的溶解實現對木質纖維素組分結構分離，以及對纖維素結晶區的破壞，從而達到預水解作用，且2%NH3+4%KOH的作用更為顯著。

圖1 稻草菌糠不同預處理前后FTIR結構變化

圖2 玉米秸菌糠不同預處理前后FTIR結構變化

圖3 麥秸菌糠不同預處理前后XRD結構變化

通過XRD對預處理前后菌糠中纖維素結晶結構變化進行分析(圖4～圖6)。發現2%NH3+2%KOH和2%NH3+4%KOH預處理分別使菌糠結晶度降低5.7%～6.9%和10.0%～15.3%，表明氨-鉀預處理能夠破壞菌糠中暴露的纖維素結晶區結構，使其氫鍵網絡重排[17]，更易于水解，且隨著KOH濃度提高，這一作用更明顯。同時FTIR也顯示，暴露出的結晶纖維素也同時發生水解，使得菌糠中纖維素轉化為更易利用的低分子量多糖或單糖組分。此外，無定型態組分如半纖維素在預處理過程中水解更為明顯，這也能進一步暴露更多的纖維素結構。

圖5 玉米秸菌糠不同預處理前后XRD結構變化

圖6 麥秸菌糠不同預處理前后XRD結構變化

2.1.3 酶水解性變化

基于上述分析，認為氨-鉀復合預處理主要通過提高菌糠中纖維素水解性來改善厭氧消化產氣性能，因此對預處理前后菌糠纖維素酶水解糖化率變化進行驗證分析。圖7所示數據點為預處理前后3種菌糠經纖維素酶水解0～120 h所得葡萄糖產率?？梢钥闯?，隨水解時間延長，葡萄糖轉化率逐漸降低，在120 h后速率趨近與零。預處理后3種菌糠在水解24 h后葡萄糖產率提高，最終葡萄糖得率也高于對應的未處理組。2%NH3+4%KOH處理菌糠葡萄糖得率提升更明顯，達到7.2%～23.3%，表明氨-鉀復合預處理確實提高了菌糠中纖維素的水解率。其中，預處理后玉米秸菌糠葡萄糖得率最高，為28.5%，表明其纖維素水解性能最佳。

利用改良Henri-Michaelis-Menten酶解二級反應動力學模型所得擬合曲線[14]如圖7所示。擬合獲得表示菌糠與纖維素酶反應的動力學參數P和K(圖8所示)。其中，P值反映木質纖維素對纖維素酶的可及性，K值表示達到最大纖維素水解率一半時的水解時間。氨-鉀復合預處理后菌糠所對應的水解動力學P值增大，且隨著處理劑濃度的提升而進一步提高。2%NH3+4%KOH預處理后3種菌糠P值提高9.0%～12.4%，表明3種菌糠中殘留纖維素對纖維素酶的可及性和可反應性在此條件下得到最大提升。氨-鉀復合預處理對3種菌糠參數K值影響不同，稻草菌糠K值基本未發生改變，玉米秸和麥秸菌糠K值降低，且2%NH3+4%KOH預處理后降低明顯，分別為36.5%和31.0%，表明氨-鉀復合預處理后菌糠達到理論最大葡萄糖轉化率所需時間減少，平均水解速率增大。

圖7 Nidetzky酶水解二級反應模型擬合曲線

圖8 Nidetzky酶水解二級反應動力學參數

利用Ohmine酶解動力學模型所得擬合曲線[14]示于圖9中，擬合獲得表示菌糠與纖維素酶反應的動力學參數v0和k(見圖10)。v0反映酶解反應初始速率，k反映酶在秸稈上的失活速率。氨-鉀復合預處理未能提高稻草和玉米秸菌糠的酶解反應初始速率，只有麥秸菌糠經2%NH3+2%KOH和2%NH3+4%KOH預處理后v0提高至未處理時的2.9～3.5倍。此外，氨-鉀復合預處理后只有稻草菌糠的k值降低。這表明氨-鉀復合預處理并未提高菌糠中纖維素初始水解速率，且預處理后菌糠水解過程中纖維素酶的脫附率有一定程度的提升，這可能是由于堿金屬離子K+的存在占據了纖維素酶的吸附位點[18]，使得纖維素酶在改性菌糠上的脫附率有所提高。由于纖維素結晶結構的破壞，盡管有效吸附時間縮短，纖維素酶的有效水解效率仍有所提升，最終反映為預處理后菌糠纖維素水解率的增加。綜合兩種動力學分析結果認為2%NH3+4%KOH預處理對玉米結菌糠酶水解的提升效果最佳。

圖9 Ohmine酶水解反應模型擬合曲線

圖10 Ohmine酶水解反應模型動力學參數

2.2 氨-鉀復合預處理對菌糠厭氧消化產氣性能的影響

2.2.1 產甲烷潛力

產甲烷潛力能夠直接反映氨-鉀復合預處理對菌糠厭氧消化性能的影響。表3所示為氨-鉀復合預處理3種菌糠及相應對照組的甲烷產率和甲烷轉化速率。結果顯示，不同濃度條件下，氨-鉀復合預處理稻草、玉米秸和麥秸菌糠的甲烷產率分別為262 mL·g-1VS(2%NH3+2%KOH)和276 mL·g-1VS(2%NH3+4%KOH)，295 mL·g-1VS(2%NH3+2%KOH)和306 mL·g-1VS(2%NH3+4%KOH)，263 mL·g-1VS(2%NH3+2%KOH)和279 mL·g-1VS(2%NH3+4%KOH)，相較對照組分別提高了13.9%和20.0%，18.0%和22.4%，10.0%和16.7%。表明氨-鉀復合預處理能夠提高菌糠厭氧消化甲烷轉化率，且隨著KOH添加濃度的提高效果更明顯。

表3 不同預處理條件菌糠秸稈甲烷產率、生物降解率及動力學參數

甲烷轉化速率同樣是表征底物厭氧消化性能的重要參數，可以間接反映厭氧消化水解階段的反應速率。通過一級動力學模型擬合可以得到氨-鉀復合預處理對菌糠甲烷轉化速率的影響。經過2%NH3+2%KOH處理后3種菌糠甲烷轉化速率提高了27.5%～80.8%，2%NH3+4%KOH處理后甲烷轉化速率提高了67.5%～145.0%。結合預處理后菌糠可溶性組分和結構變化，以及酶水解性能的提升，可以推斷氨-鉀復合預處理通過對菌糠中木質纖維素的預水解作用，提高其在厭氧消化水解階段的反應速率，從而提高甲烷轉化速率和甲烷轉化率。隨著KOH濃度的升高，預處理作用更明顯。其中2%NH3+4%KOH預處理后玉米秸菌糠產氣性能提升最明顯，與預處理效果分析所得結論一致。

2.2.2 生物降解性

生物降解性能夠從另一方面反映氨-鉀復合預處理對菌糠產甲烷性能的影響。3種菌糠在不同預處理條件下的生物降解性示于表3中。

氨-鉀復合預處理后稻草菌糠生物降解性分別為81.9%和88.4%，比對照組分別提高27.4%和34.0%；相似的情況，預處理后玉米秸菌糠、麥秸菌糠的生物降解性分別為84.9%,93.3%和77.6%,84.4%，相較對應的未處理組提高30.7%，39.1%和31.6%，38.4%。由此可見，氨-鉀復合預處理能夠明顯提高菌糠在厭氧消化過程中的生物降解性，即微生物對基質的可利用程度，從而提高了最終的甲烷產率。隨著KOH濃度的提高，生物降解性提高更顯著(p<0.05)，并最終表現為基質產甲烷率的提高。氨-鉀復合預處理本質是堿預處理，其中KOH與NaOH作用相似，能夠使木質素和半纖維素之間的糖醛連接結構中的酯鍵發生皂化反應，從而發生斷裂而生成羧酸和醇結構[19]。這一過程能夠使菌糠中半纖維素溶解，提高菌糠在隨后厭氧消化中半纖維素的初始水解速率。此外，氨還可以使纖維素結晶區氫鍵減少，使氫鍵網絡重排，使其結構向無定型纖維素接近，從而提升菌糠中剩余纖維素的水解速率和總水解率[17]。KOH添加濃度的提高能夠進一步促進這一作用。2%NH3+4%KOH預處理處理對玉米秸菌糠甲烷產率和生物降解性提高最明顯，這一結果也與氨-鉀復合預處理后菌糠性質的變化一致。

3 結論

氨-鉀復合預處理通過預水解作用提高菌糠厭氧消化性能。2%NH3+4%KOH預處理條件效果更好，能夠溶解菌糠半纖維素，降解纖維素結晶結構，使稻草菌糠、玉米秸菌糠和麥秸菌糠結晶度指數分別降低10.0%，13.6%和15.3%。提高菌糠水溶性浸出物濃度，使稻草菌糠、玉米秸菌糠和麥秸菌糠SCOD含量分別提升50.4%，33.9%和36.7%；還原糖和VFAs含量分別提高至未處理的2.2，1.9，2.6倍和5.3，5.5，5.7倍。甲烷產率分別提高20.0%，22.4%和16.7%，甲烷轉化速率分別提高67.5%，145%和126.9%，生物降解性分別提高34%，39.1%和38.4%。氨-鉀復合預處理對玉米秸菌糠厭氧消化產氣性能提高效果更明顯。