復合菌劑啟動餐廚垃圾推流工藝(PFR)堆肥化過程中的微生物群落動態解析

王婧瑤，閻 中，王凱軍

(清華大學 環境學院，北京 100084)

餐廚垃圾(Food Waste，FW) 具有高有機質含量(主要是蛋白質、油脂和有機酸)、高含水率及低熱值的特性，相比于常規的固體廢物處理方法(如焚燒和填埋)，好氧堆肥更適合處理餐廚垃圾，同時以肥料的方式從中回收可再生能源。源頭收集的餐廚垃圾主要以淀粉、蛋白、脂肪等易降解物質為主，而纖維素類難降解物質含量較少。總糖、粗蛋白和粗脂肪含量高，對不同組分降解利用的微生物不同，對底物的分解消化具有階段性，微生物群落結構出現更替現象，從而造成微生物差異性較大，表現出豐富的多樣性及明顯的優勢微生物[1]。

餐廚堆肥過程是一個由細菌、放線菌、真菌等微生物共同作用并且在不同堆肥階段由不同優勢微生物群落互相演替的過程。一般堆肥物料中均含有大量的土著微生物群，隨堆肥進程微生物迅速生長繁殖而發生結構演替。而通過人為添加特定的微生物菌劑則能加快堆肥進程，促進堆肥腐熟程度，提高堆肥品質，并具有控制惡臭氣體的效果[2]。餐廚垃圾發酵中的微生物菌群可分解餐廚垃圾、抑制病原菌，是發酵反應器的核心，其種類和數量對反應器的運行至關重要。細菌由于體積小、比表面積大的特點，能快速有效地與有機物接觸，而且，在堆肥體系中細菌的數量要遠多于真菌，且耐溫性普遍強于真菌[3]。通過添加菌劑減少了堆肥的生物多樣性，迅速形成優勢菌群，促進堆肥[4]。Takaku分析了添加稻殼的餐廚垃圾堆肥系統中微生物群落的結構與變化，發現主要的細菌為擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門及放線菌門，并且發酵各階段具有不同的細菌群落[5]。Kulikowska等通過對比實驗，培養不同微生物對有機垃圾進行分解，觀察在堆肥過程中不同種類的菌劑對垃圾降解無害資源化的影響情況，對不同組分降解利用的微生物不同，對底物的分解消化具有階段性，微生物群落結構出現更替現象，從而造成微生物差異性較大，表現出豐富的多樣性及明顯的優勢微生物[6]。微生物菌劑的種類與含量是影響有機垃圾堆肥降解進程的重要因素。微生物菌劑復配方案如米曲霉、地衣芽孢桿菌、解脂假絲酵母、綠色木霉和褐球固氮菌聯合強化了廚余垃圾中脂肪、蛋白質等特異組分的降解[7]。席北斗等將污泥和有機生活垃圾的混合堆肥中添加復合微生物菌劑，復合微生物菌群各菌種之間相互協同作用，生成抗氧化物質，形成復雜而穩定的生態系統，與滅活菌的對照組比較，堆肥腐熟時間可縮短6～18天[8]。菌劑的種類對堆肥結果的影響很大[9]。Akansha Bhatia[10]等培養不同微生物對有機垃圾好氧堆肥的影響，得出微生物對底物的分解消化具有階段性，其群落結構出現更替現象，表現出豐富的多樣性及明顯的優勢微生物。鄭旴[11]等通過定性初篩和定量復篩，從202株細菌中篩選出對餐廚垃圾中淀粉、蛋白質、纖維素、油脂均有明顯降解能力的活性菌4株，菌劑的種類對堆肥結果的影響很大。

推流式反應器(Plug-flow reactor，PFR) 是有機物厭氧消化領域中最常見的反應器，理想的PFR不將底物與所有污泥完全混合，而是與部分污泥混合后從反應器的進料端進入反應器，使其在反應器長度方向呈活塞方式依次向前推進，直至反應器的出料端出料[12-13]。針對傳統工藝堆肥周期長，國內現有設備能耗高、占地大、不能連續運行等問題，本研究開發了基于PFR工藝的高溫強化生物發酵系統。本研究是通過在反應器內設置不同發酵艙，并智能控制各區域的工況條件(溫度、濕度、供氧等)，實現微生物在反應器內的分相。基于物料推流過程中的菌渣分離，確保新鮮進料與高效成熟菌體充分接觸和反應，充分利用不同區域內的微生物種群，在提供高效發酵條件的同時，實現了連續進出料，處理效果不受進料頻率影響，有機垃圾即產即清，提高了反應效率，極大降低了對周邊環境的影響；同時由于有機垃圾在高溫發酵階段才真正實現高效分解，傳統工藝在此之前需要較長啟動期實現溫度積累、微生物增殖等預過程，因此，本研究在底部設加熱裝置，解決輔料、菌種投加量大等問題，長期維持高活性腐殖化反應狀態，成功實現迅速升溫，使底物長期處于高溫發酵狀態，從而實現發酵周期的大幅縮短。

微生物群落組成和結構是餐廚垃圾有機物降解肥料化產生過程的基礎，由于啟動菌劑的施加或者各單元間的物料、環境和反應條件變化，微生物組成和多樣性會出現較大波動，進而影響餐廚垃圾處理和資源化利用過程。目前對于餐廚垃圾處理主要過程中的微生物多樣性分析仍然不足。利用宏基因組技術研究發酵體系中微生物變化，能夠揭示微生物群落的細菌種類、數量及結構，對于發酵體系降解餐廚及抑菌等功能研究極其重要。本研究基于Miseq高通量測序技術，全面分析復合菌劑餐廚垃圾處理各工藝單元的微生物種群組成和多樣性變化規律，優勢微生物及潛在病原微生物等，為優化餐廚垃圾PFR好氧處理工藝提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 菌種及餐廚垃圾底物來源

本研究案例中，菌種來源為中源創能公司篩得的復合菌系。發酵底物取自德清縣某農家樂的餐廚垃圾，經過預處理后含水率為75%。

1.2 樣品來源及PFR工藝運行

反應器采用的是該公司自主研發的小型強化連續多倉式推流發酵(PFR)反應器，日處理能力4噸以下，反應器如圖1所示，物料和菌種由1倉投加，物料緩慢流過2倉，最后到3倉腐熟，前兩倉控溫50℃～55℃，3倉為冷卻倉，考慮可能帶來微生物群落環境變化的工藝節點，本研究分別在1，2，3倉取樣，標記為C01，C02和C03。考慮到實際生產中，出料后不能馬上作為肥料運輸及使用，會有一段時間靜置期，因此將物料在空氣中放置24 h，樣品標記為Y02，菌種為Y01。無菌種發酵體系則是不接菌種，自然堆腐，3個倉的樣品分別標記為NC01，NC02和NC03。

圖1 PFR工藝示意圖

1.3 微生物Illumina MiSeq 高通量測序

提取各樣品的宏基因組DNA，擴增原核生物16SrDNA基因V3-V4區，采用Illumina進行高通量測序，進行原核微生物Alpha多樣性指數分析、相似性聚類分析及群落多樣性分析。

2 結果和分析

2.1 微生物多樣性分析數據的可靠性

稀釋曲線可以校驗微生物多樣性分析結果的數據可靠性。當曲線趨于平坦時，說明測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的 OTU; 反之則表明繼續測序還可能產生較多新的 OTU。復合菌系發酵體系5個樣本共獲得238092個有效序列，無菌種發酵體系4個樣本共獲得180741個有效序列。所有樣本的稀釋曲線接近平臺(見圖 2和圖3)，測序深度已經基本覆蓋樣本中的所有物種，覆蓋率高。說明此份數據有效可靠。

圖2 復合菌種發酵體系的稀釋曲線

圖3 無菌種發酵體系的稀釋曲線

2.2 微生物群落多樣性指數分析

Alpha多樣性是指一個特定區域或者生態系統內的多樣性。本文通過 Shannon(香農指數)，Simpon(辛普森指數)，Chao1和ACE 這4個指標對餐廚好氧發酵反應器中的群落Alpha多樣性進行分析。其中，chao1 用來估計物種總數，ACE可估計群落中 OTU 數目，Simpson和Shannon 用于估算為生物多樣性，Simpson越大多樣性越低，而Shannon越大多樣性越高。

如表1所示，無菌系發酵3個倉(NC01，NC02，NC03)的Shannon由NC01的4.26減至4.22后又升到4.36，NC02的多樣性下降，表明中間倉的物種略單一，整個發酵過程微生物多樣性波動不大，可能是由于餐廚垃圾表面的細菌在適應新的環境，處于休眠狀態，因此導致發酵體系多樣性較穩定且無規律。而復合菌種發酵體系(C01，C02，C03)中，群落多樣性隨著PFR 3個倉的不斷推流呈逐漸增加趨勢，Shannon由C01的2.69 到2.81后升至 3.39，最后出料的Shannon為3.63，可以看出菌種的啟動對于整個發酵體系的微生物群落多樣性演替至關重要。

表1 微生物群落多樣性指數分析

2.3 微生物群落聚類分析

非度量多維尺度法(NMDS)是一種將多維空間的研究對象(樣本或變量)簡化到低維空間進行定位、分析和歸類，同時又保留對象間原始關系的數據分析方法。適用于無法獲得研究對象間精確的相似性或相異性數據，僅能得到他們之間等級關系數據的情形。其基本特征是將對象間的相似性或相異性數據看成點間距離的單調函數，在保持原始數據次序關系的基礎上，用新的相同次序的數據列替換原始數據進行度量型多維尺度分析。

由圖 4 的NMDS分析可知，復合菌系啟動下的樣品C02，Y01和Y02 ，三者彼此距離互不接近，形成了一個三角形，表明三者在微生物組成上有很大的差別，三者分別代表了不同的發酵時期，即發酵菌種(Y01)、發酵中期(C02)及開袋期(Y02)。C03樣品分別與C01，C02 及Y02樣品距離較近，說明三者相比，發酵后期(C03)分別與發酵初中期(C01，C02)及開袋期(Y02)微生物群落構成相似性較大，也表明發酵初期、發酵中后期和開袋期三者之間的承繼關系。同時C01和C02最為相似，說明整個體系中的微生物在發酵初中期經歷了一個短暫的適應期。也有研究表明許多在中溫段活動的微生物在高溫段進入休眠期，然后在腐熟階段又重新開始繁殖、新陳代謝并且進行堆肥活動[14]。

圖4 復合菌種發酵體系PFR工藝中樣品的聚類情況

而對于無菌種發酵體系的樣品來說，由圖 5的NMDS分析可知，3和5兩個樣品彼此距離互不接近，表明兩者在微生物組成上有很大的差別，兩者分別代表了不同的發酵時期，即發酵前期(3)及發酵中后期(4和5)。同時樣品4和5最為相似，說明在發酵后期微生物菌系組成已經穩定。

圖5 無菌種發酵體系PFR工藝中樣品的聚類情況

2.4 微生物群落多樣性門水平分析

從門水平上分析(見圖6和圖7)，復合菌種發酵體系的3個倉的3組樣本通過Illumina Miseq 測序平臺共獲得243767條高質量有效序列，聚類分為275個操作分類單元，經分類學鑒定分屬16個門，163個屬。在門水平上，厚壁菌門 (Firmicutes) 始終占優勢地位，其次是變形菌門，最后是藍藻菌門。厚壁菌門主要以桿菌為代表，是咖啡或者稻米堆肥中高溫相的主要群落組成，Dee’s 的研究表明，厚壁菌門，尤其是桿菌，是高溫發酵階段的主要微生物群落[15]。

圖6 復合菌系發酵門水平下PFR推流工藝的發酵樣品

圖7 無菌系發酵門水平下PFR推流工藝的發酵樣品

PFR推流工藝運行下的發酵樣品，從C01到C02到C03最后再到Y02，厚壁菌門的比例由73%下降至69%再升至76%，最后穩定在75%。變形菌門從18%上升至20%后一直保持不變。盡管從門水平上看，隨著發酵的進行，各優勢菌門的比例均未有太大改變，但是在厚壁菌門中，一些種屬如鏈球菌(streptococci)、乳酸菌(lactobacillus)和微小桿菌(exiguobacterium)比例卻有所調整。

無菌種發酵體系有3大優勢菌門，變形菌門(proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門 (Bacteroidetes)。有學者研究表明，擬桿菌門(Bacteroidetes)能有效地降解大分子物質如纖維素和木質素，可以將多種多糖降解為有機酸, 厚壁菌門(Firmicutes)與擬桿菌門(Bacteroidetes)呈現相反的趨勢，因此這2個門的細菌在餐廚垃圾發酵體系中可能在降解多糖的過程中存在競爭關系[16]。

2.5 微生物群落多樣性屬水平分析

如圖8所示，復合菌種發酵體系中的優勢菌屬為乳桿菌(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、微桿菌(Exiguobacterium)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、大洋芽胞桿菌屬(Oceanobacillus)、枝芽孢菌屬(Virgibacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、中華芽胞桿菌屬(Sinibacillus)、慢生芽胞桿菌屬(Lentibacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)和克雷白氏桿菌屬(Kiebsiella)。

圖8 經復合菌系發酵(Y01，C01，C02，C03，Y02)和無菌系發酵(NC01，NC02，NC03)的屬水平的微生物群落分布圖

而作為芽孢桿菌科的梭菌屬，也出現在發酵體系中。梭菌屬一直被認為是與復雜有機物降解相關的菌類[17]，在白酒窖泥中作為重要功能菌群[18]，它是一類嚴格厭氧的細菌，在降解碳水化合物的同時會產生乙酸、丁酸等產物，在生物液體燃料領域具有很好的應用前景，受到廣泛關注[19]；另外，梭菌還可能與乙酸氧化及苯酚類化合物的降解有關[20-21]。這說明堆肥發酵的過程也不是嚴格意義上的好氧，某些沒有攪拌翻堆到的位置形成了一個個狹小的厭氧空間。

隨著發酵過程的進行，鏈球菌從38%降至發酵后的10%，由于鏈球菌是一種可以發酵簡單的糖類，產酸不產氣的致病菌，因此鏈球菌的減少意味著隨著高溫發酵的進行，有機廢棄物的分解，餐廚垃圾終被無害化處理[22]。與此同時，乳酸菌屬和微小桿菌屬增多。微小桿菌屬是一類革蘭氏染色為陽性的堿性厭氧菌，其在分解有機污染物(偶氮染料、農藥、石油等)，轉化重金屬，根際促生，工業污水處理等領域均具有一定的環境學意義[23]。

無菌系發酵的樣品NC01，NC02，NC03中的優勢菌屬為乳桿菌(Lactobacillus)、依格納季氏菌屬(Ignatzschineria)、小桿菌屬(Dialister)、擬桿菌屬(Bacteroides)，其中乳桿菌(Lactobacillus)和依格納季氏菌屬(Ignatzschineria)隸屬于變形菌門是其優勢菌屬，該種屬經常存在于雞腸道菌群中，也存在也脫氮系統中[24]。在活性污泥-生物膜復合系統脫氮除磷的研究中發現其適于附著在生物膜上生長，具有降解有機物和脫氮的優勢[25]。在擬桿菌種屬下面豐度最多的是普雷沃菌屬(prevotella)和紫單胞菌科的Proteiniphilum。普雷沃菌屬屬常見無芽孢革蘭陰性厭氧桿菌，是近年來從類桿菌屬中分出的一個新菌屬，主要集聚于正常人體的口腔、腸道等部位，它是臨床上較常見的一種條件致病菌[26]。馮蕾在低溫的條件下，用不同菌劑厭氧發酵羊糞產沼氣，發現Proteiniphilum為其中優勢菌群[27]。Proteiniphilum可以降解焦化廢水中一些生物難降解的化合物(包括苯酚，甲基苯酚，二甲基苯酚，萘酚，三亞苯和吲哚)，在pH值為8的條件下有助于增強厭氧發酵的進程[28]。這說明，若無外源菌種的接入，在餐廚垃圾自然堆腐的過程中，很多來源于腸道和口腔的微生物大量增殖，造成了無菌種發酵體系多樣性程度較高，然而并沒有文獻直接證明上述菌群的擴繁有利于好氧堆肥過程，因此解釋了上述即使香農指數高于復合菌種發酵體系，但是出料效果并不好的情況。

Bacteroidetes能夠產生纖維素酶、蛋白酶等水解酶，將纖維素、蛋白質和淀粉等大分子有機物降解產生 CO2、纖維二糖、葡萄糖和乙酸[29]。也有研究認為，Bacteroidetes是降解糖類的主要微生物菌群[30]。

2.6 微生物群落功能代謝通路分析

經過微生物群落功能代謝通路分析可知(見圖9和圖10)，復合菌系及無菌系發酵系統均是由碳水化合物運輸代謝和氨基酸轉運代謝占主導。這是由于兩者有著相似的底物組成，包含米飯、饅頭、肉類等高蛋白高碳水的物質。在微生物發酵底物過程中，碳在微生物新陳代謝過程中約有2/3變成二氧化碳而被消耗掉，1/3用于細胞質的合成，所以，碳被稱為是細菌的能源，而氮主要用于細胞原生質的合成，用于細胞繁殖[31]。由于可能收集餐廚垃圾的批次位置不同，盡管二者攜帶了不同的菌系，卻不影響其相同的底物組成下的主導代謝通路的相似性。

圖9 KEGG注釋PFR推流工藝節點下的復合菌系發酵樣品

圖10 KEGG注釋PFR推流工藝節點下的無菌系發酵樣品

3 結論與展望

本研究通過高通量測序分析獲得復合菌系啟動PFR好氧餐廚垃圾處理工藝過程的菌種對微生物種群、數量、結構、動態變化規律的影響等數據，為挖掘特定功能微生物，進一步優化餐廚垃圾處理工藝，促進PFR反應器系統的穩定和高效運行，提高餐廚垃圾發酵產物的資源化利用效率提供科學依據。

本研究的主要結論： 1)餐廚底物經復合菌種發酵后微生物多樣性在不斷增加(香農指數各個單元的變化規律為2.69—2.81—3.39)，而無菌系啟動的發酵體系微生物多樣性并無顯著增加，且雜亂無規律; 2)主成分分析表明復合菌系啟動下，前兩個倉的樣品聚類到了一起，說明發酵體系需要一個短暫的適應期; 3)在門水平上，復合菌種發酵體系中Firmicutes(厚壁菌門) 始終占優勢地位，其次是變形菌門，而無菌種發酵體系中Proteobacteria(變形菌門)為優勢菌門，Firmicutes(厚壁菌門)次之，在屬水平上，復合菌種發酵體系的優勢菌屬為Lactobacillus(乳桿菌)和Exiguobacterium(微小桿菌)，而無菌種發酵體系的優勢菌屬為Ignatzschineria(依格納季氏菌屬)和Lactobacillus(乳桿菌); 4)雖然微生物群落組成不同，但經KEGG功能注釋后發現兩體系均由碳水化合物運輸代謝和氨基酸轉運代謝占主導，系宏觀的相同餐廚底物3大類營養物質(碳水化合物、脂肪和蛋白質)所致。

基于研究結果，提出以下對策建議： 1)餐廚垃圾好氧PFR工藝優化：好氧PFR環境的群落組成結構可為反應過程性能提供參考，如厚壁菌門 (Firmicutes)和變形菌門(proteobacteria)兩者的相互作用可提高好氧堆肥過程的穩定性，降低環境因素變化對發酵過程的沖擊; 2)對于病原菌如鏈球菌屬(streptococci)等在發酵過程中的逐步減少，我們可以篩選其拮抗菌對病原菌進行控制。