雙酚A對人臍靜脈內皮細胞的影響初探

葛勇 徐甜甜 陳一蘭 吳懿 包明蒽 柴惠

目前，已有近千種化學物質被確定為潛在的內分泌干擾物，其有可能改變內分泌系統的功能，從而對一個完整的生物體或其后代造成不利影響［1］。雙酚A（BisphenolA，BPA）是一種烷基酚類環境雌激素，是世界上產量最高的內分泌干擾物之一［2］。BPA被大量使用于塑料和玩具、醫療設備等塑料制品中，能夠通過與人體不斷接觸從而使雌激素在機體內慢性蓄積［3］。雌激素在較多器官和系統的形成及功能中起重要作用，其不平衡會增加人類癌癥和生殖、神經、代謝、免疫及心血管系統疾病的風險［4］。BPA可能通過影響血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）和細胞間粘附分子-1（ICAM-1）等多種細胞因子的表達影響心血管系統的結構與功能。2018年12月至2019年11月作者通過實驗研究，探討BPA對人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）活性的影響以及對心血管系統的作用，進而分析環境雌激素在心血管疾病發展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 HUVEC細胞株（購自美國ATCC公司）。

1.2 藥品與試劑 BPA（美國Sigma）、DMEM高糖培養基（上海吉諾）、胎牛血清（杭州四季青）、二甲基亞砜DMSO（美國Sigma）、MTT染料（上海拜力）、TRIZOL（美國Ambion）、逆轉錄試劑盒（北京康為世紀）、Ultra SYBR Mixture（北京康為世紀）、BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo）。

1.3 主要儀器 CO2恒溫細胞培養箱（美國Thermo）、倒置顯微鏡（日本尼康）、臺式高速低溫離心機（德國Eppendorff）、酶標分析儀（美國Biotek）、PCR擴增儀（美國Bio-RAD）、熒光定量PCR儀（Step One Plus? Real-Time PCR System，美國 ABI）、Q5000 超微量核酸蛋白測定儀（美國Quawell）、凝膠成像儀（美國 Bio-RAD）。

1.4 方法 （1）HUVEC細胞培養：將HUVEC細胞培養于DMEM高糖型培養基（含10%的胎牛血清）中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。每隔48h更換培養液，并在顯微鏡下觀察細胞生長狀態。當細胞融合率>80%時，按1∶2的比例傳代培養。（2）MTT法分析BPA對HUVEC細胞抑制率的影響：將處于對數生長期的HUVEC細胞種于96孔板中。培養24h后，設置空白對照組（DMEM培養液），溶劑對照組（含1‰的無水乙醇）和BPA干預組（BPA濃度分別為10-3μmol/L，10-2μmol/L，10-1μmol/L，1μmol/L，10μmol/L，102μmol/L，103μmol/L），每組設置 6個復孔。處理24h后，每孔各加MTT溶液20μl并搖勻，37℃溫育4h。棄去原有液體，加入150μl DMSO，反應15min。在酶標儀中以490nm測定吸光度（OD值），并計算細胞抑制率（抑制率=1-ODBPA干預組/OD空白對照組）。（3）HUVEC 細胞中 VCAM-1和ICAM-1的mRNA和蛋白質表達測定：①HUVEC細胞分組處理：將處于對數生長期的HUVEC細胞種于24孔板中。培養24h后，設置空白對照組（DMEM培養液），溶劑對照組（含1‰的無水乙醇）和BPA干預組（BPA濃度分別為0.5μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，50μmol/L，200μmol/L，500μmol/L），每組設置3個復孔。②HUVEC細胞mRNA的提?。焊鹘M加Trizol裂解細胞，常規提取mRNA，按反轉錄試劑盒說明配制20μl體系反應液，置于PCR儀中，反轉錄成cDNA。③實時熒光定量PCR檢測HUVEC細胞中VCAM-1、ICAM-1的mRNA表達水平：PCR反應體系為2×Ultra SYBR Mixture 10μl，VCAM-1/ICAM-1/β-actin上 下 游 引 物 各 0.5μl，Template DNA 1μl，RNase-Free Water 8μl，共計 20μl。引物序列設計及合成由上海桑尼生物科技有限公司完成。VCAM-1 上游 ：5'-CCAGAATCTAGATATCTTGCTC-3'，下 游 ：5'-CAGCCTGTCAAATGGGTATAC-3'；ICAM-1上 游 ：5'-TGAACAGAGTGGAAGACATATGCC-3'， 下游：5'-TCAGATGCGTGGCCTAGTGTT-3'；β-actin上游：5'-AAATGCTTCTAGGCGGACTATGA-3'， 下 游：5'-TTTCTGCGCAAGTTAGGTTTTG-3'。實時熒光定量PCR的反應條件：95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃退火/延伸1min，擴增40個循環，最后為溶解曲線步驟。采用2-△△Ct方法分析目的基因mRNA的表達水平。④蛋白免疫印跡檢測HUVEC細胞中VCAM-1和ICAM-1的蛋白表達水平：各組經裂解提取細胞的總蛋白，用Q5000超微量核酸蛋白測定儀測定所得蛋白濃度。取適量濃度蛋白溶液制樣，樣品經5%濃縮膠、10%分離膠SDS-PAGE電泳分離。電泳結束后，將蛋白轉移到PVDF膜上（4℃過夜）。室溫下封閉2h（5%脫脂奶粉），與一抗孵育過夜（4℃，搖床）。與辣根過氧化物酶標記的二抗共同孵育2h（室溫，搖床）。用TBST溶液雜交膜充分洗凈后，顯影定影。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以（）表示，各組間用單因素方差分析及Turkey多重比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度BPA對細胞的抑制作用 溶劑對照組與空白對照組比較，差異無統計學意義。除BPA最低濃度組（10-3μmol/L）外，其他濃度（10-2μmol/L，10-1μmol/L，1μmol/L，10μmol/L，102μmol/L，103μmol/L）均對HUVEC有抑制作用，且隨著BP濃度的增加，其抑制作用逐漸增強，細胞活力逐漸下降。見圖1。

圖1 不同濃度BPA 對細胞的抑制作用

2.2 不同濃度BPA對細胞中VCAM-1的mRNA表達的影響 溶劑對照組與空白對照組比較，差異無統計學意義。隨著BPA濃度升高，HUVEC細胞中的VCAM-1和ICAM-1mRNA表達量顯著上調。見圖2、圖3。

圖2 不同濃度BPA 對細胞中VCAM-1的mRNA表達的影響

圖3 不同濃度BPA 對細胞中ICAM-1的mRNA表達的影響

2.3 不同濃度BPA對HUVEC細胞VCAM-1和ICAM-1蛋白表達的影響，溶劑對照組與空白對照組比較，差異無統計學意義。隨著BPA濃度升高，HUVEC細胞中的VCAM-1和ICAM-1的蛋白表達量顯著上調。見圖4～6。

圖4 不同濃度BPA對HUVEC細胞VCAM-1和ICAM-1蛋白表達影響

圖5 不同濃度BPA對HUVEC細胞VCAM-1蛋白表達影響

圖6 濃度BPA對HUVEC細胞VCAM-1蛋白表達的影響

3 討論

BPA在不同國家的多數人群的血清、尿液、母乳和唾液中均能被檢測到［5］。流行病學研究表明，尿液或血清中的BPA水平與各種心血管系統疾病的發作風險呈正相關［6］。最近多項研究也表明暴露BPA會增加小鼠的動脈粥樣硬化［7］，并改變小鼠和大鼠的心臟功能［8-10］，提示BPA暴露可能是心血管系統疾病發生的一個危險因素。然而關于BPA如何在細胞水平引起心血管系統疾病尚不清楚。

內皮細胞的改變在較多心血管系統疾病的不同發病機制中起關鍵作用，研究表明，內皮功能障礙可作為未來心血管事件風險的指標［11］。血管內皮功能障礙是動脈粥樣硬化的早期和關鍵信號，以粘附分子表達增多為表型特征，包括血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）和細胞間粘附分子 -1（ICAM-1）［12］。VCAM-1定位于活化的內皮細胞表面，被認為是動脈粥樣硬化的關鍵介質。其能與T淋巴細胞和單核細胞表達的因子結合，促進白細胞的形成［13］。ICAM-1是另一種內皮粘附分子，作為白血球和內皮細胞跨膜的蛋白質，在穩定細胞間相互作用和促進白血球、內皮細胞的遷移中起到重要作用。研究表明，ICAM-1的水平與人類動脈粥樣硬化的程度相關，ICAM-1的下調能夠減輕載脂蛋白缺乏小鼠的血管病變［14］。

近年來，高血壓、糖尿病、冠心病等心血管系統疾病患病率在全球范圍內迅速上升［15］。除傳統風險因素外，環境激素干擾的因素也逐漸引起關注。研究表明，環境激素可能通過其在體內的分泌、運輸及代謝等活動誘導心血管系統疾病，特別是BPA，已被懷疑是這些疾病潛在病因［16］。BPA是一種合成單體，用于聚碳酸酯塑料和環氧樹脂的制造，在新生兒、兒童和成人的尿液、血液、唾液、胎盤組織、脂肪組織和母乳中均能被檢測到［17］。關于BPA的大多數研究均圍繞其與生殖系統毒性的關系展開。然而，有關BPA與心血管系統疾病聯系的流行病學研究報告在幾年內大量增加，支持BPA在心血管系統疾病中的作用，但缺乏相關體內外實驗，其具體作用機制尚不完全清楚［18-20］。

本研究結果顯示，BPA干預組的細胞抑制率均大于空白對照組和溶劑對照組，且呈劑量依賴性，VCAM-1和ICAM-1的mRNA和蛋白表達也顯著增加，提示BPA可能通過影響HUVEC細胞的生長活力及VCAM-1、ICAM-1的表達，參與心血管疾病的發生和發展。該結果可能為明確 BPA 對心血管疾病的發病機制提供理論依據。然而，關于BPA對HUVEC細胞的深入機制有待進一步研究。已有研究表明，BPA可能對人的原代內皮細胞產生直接的促血管生成作用，提示人的內皮細胞可能是BPA的重要靶點［21］。內皮細胞結構及功能完整性對于維持血管穩態有重要作用，內皮細胞功能障礙可能導致單核細胞浸潤、脂質堆積、斑塊阻塞血管，最后導致心血管疾病發生［22］。VCAM-1、ICAM-1是重要的血管細胞粘附分子，參與細胞的識別、活化、信號轉導以及細胞的增殖分化、伸展移動［23］。VCAM-1、ICAM-1的激活能夠使血管壁發生炎性細胞粘附，釋放多種促細胞增殖因子從而促進血管壁細胞增殖及遷移。血管細胞粘附分子所介導的炎癥細胞與血管內皮細胞的作用，可能加劇心血管疾病的病理生理過程。研究表明，在心血管疾病中，VCAM-1、ICAM-1的表達升高是內皮功能障礙的重要標志［24］。因此，明確BPA對HUVEC細胞中VCAM-1和ICAM-1表達的影響，對于探究其在心血管疾病發病中的作用十分重要。

綜上所述，BPA能抑制HUVEC細胞的增殖活力，且在分子生物學水平上發現BPA能增加HUVEC細胞中VCAM-1和ICAM-1的mRNA和蛋白質表達水平，提示其炎癥在BPA誘導的心血管疾病中具有重要作用，為探索環境因素對心血管系統發病的影響提供理論依據。