環狀RNA Hsa_circ_0102434在胃癌中的表達及其臨床價值研究

張晨靜 王婧雅 耿曉歌 潘文勝

全球范圍內，胃癌（GC）發病率和病死率分別位列惡性腫瘤的第2位和第3位。我國胃癌每年新發病例為67.91萬，死亡病例為49.8萬，發病人數和死亡人數均高居惡性腫瘤第2位，且呈現上升趨勢［1］。研究表明ncRNA在腫瘤的發生發展中發揮重要作用［2］。環狀RNA（circular RNA，circRNA）是由反向剪接反應（back-splicing）的特殊剪接機制形成的、具有閉合環狀結構、大量存在于真核轉錄組中的一類特殊的非編碼RNA［3］。相較于線性非編碼RNA，circRNA分子呈封閉環狀結構，不受RNA外切酶影響，表達更穩定。有研究表明 circRNA 可以在轉錄以及轉錄后等多個層面上調節基因的表達，對機體的多種生理及病理過程起著重要的調控作用［3］。本文探討環狀RNA Hsa_circ_0102434在胃癌中的表達及其臨床價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年5月至2018年7月浙江大學第二附屬醫院和浙江省人民醫院的原發性胃癌患者，選擇術前未行放療及化療的患者46例。采集所有患者術中腫瘤組織和距離腫瘤>5cm的正常癌旁組織。手術切除后，收集組織樣品并在液氮中冷凍，然后再檢測。本研究經杭州醫學院倫理委員會批準（2018KT085）。

1.2 方法 （1）RNA提取和純化：通過TRIzol（美國Invitrogen公司）提取每個樣品的總RNA，使用Agilent 2100生物分析儀檢查RNA的濃度、純度和完整性。然后，使用SuperScriptTM IV合成系統（美國，Invitrogen）將RNA純化并逆轉錄為cDNA。（2）熒光定量PCR：采用TB GreenTM Premix DimerEraserTM（完美實時）在ABI 7900 Real-Time PCR System（美國Thermo Fisher Scientific）上通過qRT-PCR擴增。以GAPDH為內參，校正每個樣本的Ct，計算△Ct值，以2-△△Ct計算基因表達。將PCR產物送廣州吉賽生物公司科技有限公司進行測序，以確保環狀RNA檢測的準確性。見表1。

表1 用于qRT-PCR檢測的引物序列

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0及GraphPad Prism 5.0軟件統計。計量資料比較采用t檢驗。Hsa_circ_0102434的表達水平與患者臨床病理指標間的關系用單因素方差分析（ANOVA）。利用ROC曲線分析環狀RNA在組織中的表達差異作為胃癌診斷指標的可能性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 環狀RNA Hsa_circ_0102434在胃癌組織中表達 與癌旁組織相比，Hsa_circ_0102434在胃癌組織中的表達明顯上調（P=0.0002）。見圖1。將PCR產物送吉賽公司測序，結果確認該序列為帶有反向剪接位點的Hsa_circ_0102434。見圖2。

圖1 Hsa_circ_0102434在胃癌組織及癌旁組織中表達水平

圖2 剪切位點測序圖

2.2 胃癌組織中環狀RNA Hsa_circ_0102434表達量與臨床病理特征的相關性 將胃癌組織中環狀RNA Hsa_circ_0102434的表達量取中位數分為低表達組與高表達組，進一步分析患者Hsa_circ_0102434表達水平與其臨床病理指標的相關性。結果顯示，Hsa_circ_0102434高表達與遠處轉移相關（P<0.05），與性別、年齡、腫瘤大小、病理分期、腫瘤分化程度、血管浸潤及淋巴結轉移無關（見表2）。

表2 環狀RNA Hsa_circ_0102434的表達水平與胃癌臨床病理指標間的關系

2.3 環狀RNA Hsa_circ_0102434可作為胃癌的診斷標志物 為了進一步研究RNA Hsa_circ_0102434對胃癌的診斷價值，以Hsa_circ_0102434在組織中的表達作為指標繪制ROC曲線（見圖3），結果顯示曲線下面積 0.743（95%CI 0.642～0.844，P<0.0001），敏感度和特異度分別是78.3%和60.9%，診斷臨界值是1.605，約登指數為0.392。

圖3 Hsa_circ_0102434的ROC曲線

3 討論

環狀RNA曾經被認為是由低豐度和技術局限性引起的剪接錯誤的副產物，而近年來，隨著RNA-seq和生物信息學分析的發展，環狀RNA受到廣泛關注。與線性RNA不同，cir-cRNA通過外顯子環化或內含子環化將3'和5'末端連接在一起形成共價閉環結構。環狀RNA在生物中豐富，多樣且穩定。較多研究人員發現環狀RNA在調控中起重要作用［1-3］。最近研究也發現環狀RNA參與腫瘤的發生發展，但其作用機制尚不清楚。

一些研究發現circRNA可作為微小RNA海綿（miRNA sponge）發揮作用［4］，例如，在肝癌中CDR1as高表達，能夠通過抑制miRNA-7發揮促癌作用［5］；又如，circHIPK3通過抑制miRNA-124調控腫瘤生長［6］。全基因組研究表明miRNA海綿機制并非普遍適用［3，7］，其它一些機制也相繼被提出。最近研究發現，在某些特殊情況下，環狀RNA脫離其非編碼RNA的屬性（不能編碼蛋白質），可作為蛋白質合成過程中的翻譯模板，指導功能蛋白的合成［8］。如環狀RNA來源的蛋白質/多肽在肌形成以及細胞應激過程中發揮重要的生物學功能［9-10］；環狀RNA SHPRH能夠通過合成一種新型蛋白參與膠質瘤的發生發展［11］。越來越多研究表明，環狀RNA在腫瘤的發生和腫瘤的發展中起著重要的作用。如，Hsa_circ_0001649在肝細胞癌中表達下調［12］；Hsa_circ_100855和Hsa_circ_104912在喉鱗狀細胞癌（LSCC）組織中表達失調［13］；胃癌Hsa_circ_002059表達的降低與遠端轉移，TNM分期，性別和年齡顯著相關［14］。作者前期應用高通量測序對胃癌組織及癌旁組織分析發現Hsa_circ_0102434在胃癌組織及癌旁組織中差異表達，進一步qRT-PCR研究結果顯示Hsa_circ_0102434在胃癌組織中的表達明顯上調；進一步研究發現，Hsa_circ_0102434的表達與胃癌的遠處轉移相關，遠處轉移是評估腫瘤的關鍵因素，提示Hsa_circ_0102434可能與胃癌的進展關系密切。本資料顯示，Hsa_circ_0102434對胃癌的診斷結果顯示曲線下面積 0.743（95%CI 0.642～0.844，P<0.0001），具有較高的診斷效能，以1.605為診斷臨界值，敏感度和特異度分別為78.3%和60.9%，提示將胃鏡常規活檢組織行Hsa_circ_0102434檢測作為潛在胃癌診斷方法，為開發新型胃癌診斷標志物提供基礎。

綜上所述，Hsa_circ_0102434在胃癌組織中表達升高，與胃癌進展關系密切，同時對胃癌具有一定的診斷價值，是篩查胃癌的潛在生物標志物。