冬凌草提取物治療非酒精性脂肪性肝病的作用及機制分析

成伯寧 劉殿雷 史婷婷 田芳 金劍虹

臨床醫學將酒精及其他明確的損肝因素之外因素導致的機體肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的病理綜合征稱為非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），是一種臨床較為常見的代謝應激性肝損傷［1］。在我國，NAFLD發病率僅次于病毒性肝炎，已經成為第二大肝病，且NAFLD患者逐漸年輕化，因此尋找一種安全有效的治療方法具有重要意義［2］。臨床較為常用的治療NAFLD的方法為飲食控制、運動等，藥物治療雖然能夠對患者肝臟血脂水平進行有效控制，但并不能達到理想的治療效果。有研究表示，長期用藥可能會對肝腎功能造成損傷，因此大多數學者開始致力于中藥治療NAFLD的研究［3］。作者應用冬凌草對NAFLD大鼠進行干預，探討其干預效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物：選取60只SD健康雄性大鼠，由吉林大學動物實驗中心提供，年齡8～10個月，平均（8.9±0.5）個月，體重217～242g，平均體重（230.2±10.3）g。在相對濕度30%-35%、溫度（23.8±1.5）℃的環境中喂養1周，光照12h/d。本研究獲本院倫理委員會批準。（2）主要試劑：小鼠抗大鼠TG、TC抗體（Invitrogen公司）；兔抗小鼠LDL、HDL抗體（Selleck公司）；大鼠抗小鼠FFA抗體（Hyclone公司）；兔抗大鼠ALT、AST抗體（Sigma公司）；小鼠抗兔MDA、SOD、GSH-Px抗體（BD公司）；兔抗小鼠Bcl-2、Bax抗體（Dako公司）；大鼠抗兔Caspase3抗體（Gibco公司）。

1.2 方法 （1）建模及分組干預：參照吳鵬波等［4］研究中建模方法，并做出適當改動，隨機選取50只大鼠建立NAFLD模型：適應性喂養1周之后，使用高糖高脂飼料連續喂養50d。其余10只大鼠正常飼養，自由飲水。將50只NAFLD模型大鼠隨機分為模型組、藥物對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組各10只，其余10只大鼠為正常組。正常組、模型組大鼠使用生理鹽水進行灌胃處理，藥物對照組大鼠使用非諾貝特溶液進行干預，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠分別使用20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg冬凌草提取物溶液進行灌胃處理。所有大鼠均連續干預4周。（2）標本采集：取各組大鼠尾部靜脈血2ml，2000r/min離心15min，分離上清液，于-80℃保存。使用戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉處理，取肝臟組織，液氮冷凍后進行切片處理，進行紅油O染色。（3）脂肪酶法檢測TG水平：使用脂肪酸對甘油三酯進行水解，并使用甘油激酶對生成的甘油進行催化，生成3-磷酸甘油后使用甘油磷酸氧化酶進行催化，對血清TG水平進行計算。（4）膽固醇氧化酶法檢測TC水平：準備3個試管并分別標記為標準管、測定管及空白管，標準管中添加50μl膽固醇標準液、1.5μl酶試劑；測定管中添加50μl血清、1.5μl酶試劑；空白管中添加50μl蒸餾水、1.5μl酶試劑。3個試管分別搖晃均勻，常溫環境靜置5～10min后使用分光光度計進行比色，在500nm波長處以空白管調零，記錄吸光度，并對血清TC水平進行計算。（5）酶聯免疫吸附實驗法檢測HDL、LDL、FFA、MDA、SOD、GSH-Px水平：取50ml碳酸鹽包緩沖液對抗原進行稀釋，將其加入聚苯乙烯的反應孔中，加蓋處理后，在溫度4℃的條件下放置24h，次日洗滌3次后，拋干，在每孔中均加入稀釋液（pH值為7.4，0.02mol/L，Tris-HCl緩沖液）稀釋的待測標本0.1ml，并加入陽性和陰性對照標本，在溫度為42℃的條件下放置60min，將液體移除并洗滌3次后，拋干，在每孔中加入HDL、LDL、FFA、MDA、SOD、GSHPx抗體0.1ml，再次放置60min，將液體移除并洗滌3次，拋干，并在每孔中加入底物液（0.1mol/L的Na2HPO4，0.05mol/L的枸櫞酸）混勻，且加入0.1ml鄰苯二胺，遮光20min，再次加入2mol/L H2SO40.05ml放置各孔內，終止反應。使用酶標儀檢測A450值，分析HDL、LDL、FFA、MDA、SOD、GSH-Px水平。（6）免疫透射比濁法檢測ALT、AST水平：準備3個試管并分別標記為標準管、測定管及空白管，3個試管中均加入350μl緩沖液，標準管中加入20μl ALT、AST標準液，測定管中加入20μl血清，空白管中加入20μl蒸餾水，3個試管分別搖晃均勻，常溫環境靜置5～10min后使用分光光度計進行比色，在500nm波長處以空白管調零，記錄吸光度，對血清ALT、AST水平進行計算。（7）TUNEL法檢測肝臟組織細胞凋亡情況：對待測標本進行脫蠟、清洗，常溫環境中使用20μg/ml蛋白酶K培養0.5h后將組織蛋白去除，使用PBS緩沖液進行徹底清洗，之后將平衡緩沖液100μl加入其中，室溫環境中平衡10min，之后滴入TdT酶反應液100μl，避光、室溫環境中孵育1h后加入100μl SSC溶液，常溫環境中靜置20min后清洗3次，之后使用DAPI復染，避光培養10min后再次進行浸洗，封片觀察。DAPI復染細胞核呈藍色，凋亡細胞細胞核呈綠色，取每切片3個視野進行觀察、計算細胞凋亡率，計算平均值。（8）Western blot法檢測Bcl-2、Bax、Caspase3相對表達量：使用PBS緩沖液對標本沖洗之后裂解30min，測定蛋白濃度。取20μg/孔蛋白質，添加蛋白緩沖液后進行電泳，10min后將電轉膜置于10%的牛奶中浸泡，常溫環境下封閉90min。之后結合一抗、稀釋，孵育1d，取出后使用TBST液沖洗，結合二抗，60min后清洗、顯色，對細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3表達進行檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件。計量資料用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清、肝臟中TG、TC、FFA、LDL、HDL水平比較 模型組大鼠血清、肝臟中TG、TC、FFA、LDL水平均高于正常組，HDL水平低于正常組；藥物對照組及低、中、高劑量組大鼠血清、肝臟中TG、TC、FFA、LDL水平均高于正常組，低于模型組，HDL水平低于正常組，高于模型組，且藥物對照組、高劑量組大鼠血清、肝臟中TG、TC、FFA、LDL水平均低于低劑量組、中劑量組，HDL水平均高于低劑量組、中劑量組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1、2。

表1 各組大鼠血清TG、TC、FFA、LDL、HDL水平比較（）

表1 各組大鼠血清TG、TC、FFA、LDL、HDL水平比較（）

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與藥物對照組比較，cP<0.05；與低劑量組比較，dP<0.05；與中劑量組比較，eP<0.05

組別 只數 TG（mmol/L） TC（mmol/L） FFA（μmol/L） LDL（mmol/L）HDL（mmol/L）模型組 10 1.47±0.11a 6.33±0.81a 343.77±43.26a 2.08±0.28a 0.33±0.03a藥物對照組 10 0.91±0.05ab 3.66±0.33ab 128.26±19.67ab 0.65±0.06ab 0.68±0.06ab低劑量組 10 1.31±0.08abc 5.46±0.46abc 195.34±27.22abc 1.46±0.16abc 0.43±0.04abc中劑量組 10 1.12±0.06abcd 4.61±0.41abcd 172.66±25.30abcd 1.13±0.11abcd 0.54±0.05abcd高劑量組 10 0.99±0.06abde 3.98±0.32abde 147.78±20.03abde 0.92±0.05abde 0.61±0.07abde正常組 10 0.79±0.03 1.92±0.15 110.32±15.33 0.12±0.02 0.82±0.12

表2 各組大鼠肝臟中TG、TC、FFA、LDL、HDL水平比較（）

表2 各組大鼠肝臟中TG、TC、FFA、LDL、HDL水平比較（）

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與藥物對照組比較，cP<0.05；與低劑量組比較，dP<0.05；與中劑量組比較，eP<0.05

組別 只數 TG（mmol/L） TC（mmol/L） FFA（μmol/L） LDL（mmol/L） HDL（mmol/L）模型組 10 1.55±0.13a 1.38±0.11a 265.37±25.31a 1.85±0.22a 0.19±0.02a藥物對照組 10 0.89±0.05ab 0.91±0.06ab 114.05±13.52ab 0.51±0.07ab 0.57±0.07ab低劑量組 10 1.22±0.09abc 1.23±0.09abc 183.22±19.16abc 1.39±0.15abc 0.30±0.03abc中劑量組 10 1.06±0.07abcd 1.12±0.07abcd 163.71±15.67abcd 0.86±0.09abcd 0.41±0.06abcd高劑量組 10 0.96±0.06abde 0.99±0.05abde 122.11±12.98abde0.59±0.06abde 0.52±0.07abde正常組 10 0.75±0.02 0.76±0.03 86.58±9.25 0.08±0.01 0.67±0.09

2.2 各組大鼠ALT、AST水平比較 模型組大鼠ALT、AST水平高于正常組；藥物對照組、低、中、高劑量組大鼠ALT、AST水平均高于正常組，低于模型組，且藥物對照組、高劑量組大鼠ALT、AST水平均低于低、中劑量組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠ALT、AST水平比較（）

表3 各組大鼠ALT、AST水平比較（）

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與藥物對照組比較，cP<0.05；與低劑量組比較，dP<0.05；與中劑量組比較，eP<0.05

組別 只數 ALT（U/L） AST（U/L）模型組 10 68.55±6.22a 142.33±17.65a藥物對照組 10 43.61±3.91ab 84.51±8.26ab低劑量組 10 59.32±4.71abc 123.41±12.97abc中劑量組 10 51.25±4.26abcd 103.56±9.35abcd高劑量組 10 45.35±3.89abde 89.97±7.95abde正常組 10 29.31±3.25 73.26±6.16

2.3 各組大鼠血清MDA、SOD、GSH-Px水平比較 模型組大鼠血清MDA水平高于正常組，SOD、GSH-Px水平低于正常組；藥物對照組、低、中、高劑量組大鼠血清MDA水平高于正常組，低于模型組，SOD、GSH-Px水平低于正常組、高于模型組，且藥物對照組、高劑量組大鼠血清MDA水平低于低、中劑量組，SOD、GSH-Px水平高于低、中劑量組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

表4 各組大鼠血清MDA、SOD、GSH-Px水平比較（）

表4 各組大鼠血清MDA、SOD、GSH-Px水平比較（）

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與藥物對照組比較，cP<0.05；與低劑量組比較，dP<0.05；與中劑量組比較，eP<0.05

組別 只數 MDA（μmol/L） SOD（nU/mL） GSH-Px（U/L）模型組 10 39.67±4.61a 59.63±6.37a 61.33±6.71a藥物對照組 10 23.83±2.56ab 82.29±7.65ab 78.01±8.03ab低劑量組 10 32.67±3.51abc 65.33±6.76abc 66.82±7.13abc中劑量組 10 29.16±2.97abcd 70.11±7.20abcd 71.52±7.56abcd高劑量組 10 25.56±2.63abde 77.03±7.59abde 75.83±7.95abde正常組 10 19.23±2.31 92.16±8.97 91.22±9.03

2.4 各組大鼠肝組織細胞凋亡率比較 模型組大鼠肝組織細胞凋亡率高于正常組；藥物對照組、低、中、高劑量組細胞凋亡率高于正常組，低于模型組，且藥物對照組、高劑量組細胞凋亡率低于低、中劑量組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表5。

表5 各組大鼠肝組織細胞凋亡率比較（）

表5 各組大鼠肝組織細胞凋亡率比較（）

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與藥物對照組比較，cP<0.05；與低劑量組比較，dP<0.05；與中劑量組比較，eP<0.05

組別 只數 凋亡率模型組 10 36.51±3.52a藥物對照組 10 11.22±1.97ab低劑量組 10 23.61±2.86abc中劑量組 10 16.37±2.34abcd高劑量組 10 13.08±1.85abde正常組 10 2.68±0.32

2.5 各組大鼠Bcl-2、Bax、Caspase3相對表達量比較 模型組大鼠Bcl-2相對表達量低于正常組，Bax、Caspase3相對表達量高于正常組；藥物對照組、低、中、高劑量組大鼠Bcl-2相對表達量低于正常組，高于模型組，Bax、Caspase3相對表達量高于正常組，低于模型組，且藥物對照組、高劑量組大鼠Bcl-2相對表達量高于低、中劑量組，Bax、Caspase3相對表達量低于低、中劑量組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表6。

表6 各組大鼠Bcl-2、Bax、Caspase3相對表達量比較（）

表6 各組大鼠Bcl-2、Bax、Caspase3相對表達量比較（）

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與藥物對照組比較，cP<0.05；與低劑量組比較，dP<0.05；與中劑量組比較，eP<0.05

組別 只數 Bcl-2 Bax Caspase3模型組 10 0.31±0.01a 1.69±0.19a 1.73±0.22a藥物對照組 10 0.83±0.07ab 1.01±0.12ab 1.16±0.10ab低劑量組 10 0.51±0.03abc 1.45±0.18abc 1.56±0.19abc中劑量組 10 0.67±0.05abcd 1.27±0.15abcd 1.39±0.14abcd高劑量組 10 0.77±0.08abde 1.08±0.11abde 1.24±0.09abde正常組 10 1.03±0.11 0.86±0.07 0.95±0.06

3 討論

冬凌草是一種唇形科植物，有較為悠久的入藥歷史，具有抗炎、清熱、降血脂、抗衰老、抗腫瘤等多種藥理作用［5］。宋琪雯等［6］研究認為，使用冬凌草對酒精性肝損傷模型大鼠進行干預，能夠改善大鼠肝功能，減輕肝損傷程度，并由此得出冬凌草具有一定肝保護作用的結論。大量臨床研究結果顯示，NAFLD癥狀發生發展伴隨著機體血脂水平異常［7］。本研究結果顯示，相比正常大鼠，NAFLD大鼠TG、TC、FFA、LDL水平較高，HDL水平較低，表明NAFLD癥狀的發生發展與機體血脂水平變化密切相關。使用冬凌草對NAFLD大鼠進行干預，TG、TC、FFA、LDL水平明顯下降，HDL水平明顯上升，且冬凌草濃度越高，TG、TC、FFA、LDL、HDL水平變化幅度越明顯，表明冬凌草能夠改善機體血清、肝臟內脂質含量，調控血脂水平，從而起到對NAFLD的干預效果，且具有一定的濃度依賴性。

隨著NAFLD癥狀的發生發展，機體肝功能會出現一定程度的損傷［8］。本研究結果顯示，使用冬凌草進行干預后，NAFLD大鼠ALT、AST水平出現下降，且冬凌草濃度越高，ALT、AST水平下降幅度越明顯，表明使用冬凌草對NAFLD大鼠進行干預，能夠發揮肝保護作用，有效提升大鼠肝功能，且具有一定的濃度依賴性。NAFLD癥狀的發生發展與機體肝組織細胞氧化應激損傷密切相關［9］。本研究結果顯示，使用冬凌草進行干預后，NAFLD大鼠MDA水平下降，SOD、GSH-Px水平上升，表明NAFLD大鼠肝組織細胞存在較為嚴重的氧化應激損傷，使用冬凌草進行干預，能夠減輕氧化應激損傷，達到干預效果。NAFLD癥狀癥狀的發生發展與機體肝臟組織細胞凋亡情況具有密切聯系［10］。本研究結果顯示，使用冬凌草進行干預后，NAFLD大鼠肝細胞凋亡率明顯下降，表明冬凌草能夠抑制NAFLD大鼠肝臟組織細胞凋亡，且呈現一定濃度依賴性。出現這一結果的原因可能是因冬凌草對線粒體凋亡通路產生影響。Bcl-2、Bax、Caspase3作為三種標志性的凋亡蛋白，與細胞生長發展密切相關。本研究結果顯示，使用冬凌草進行干預后，NAFLD大鼠Bcl-2相對表達量上升，Bax、Caspase3相對表達量下降，表明冬凌草能夠影響線粒體凋亡通路，調控Bcl-2、Bax、Caspase3表達，抑制NAFLD大鼠肝組織細胞凋亡，延緩NAFLD的發生發展。

綜上所述，使用冬凌草提取物對NAFLD模型大鼠進行干預，能夠改善大鼠血清、肝臟中脂質含量，提升NAFLD大鼠肝功能，減輕大鼠肝組織細胞氧化應激損傷，并能調控線粒體凋亡通路蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3的表達，抑制大鼠肝組織細胞凋亡，延緩NAFLD的發生發展。